低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗及其应用。通过对Eculizumab单抗框架区氨基酸序列进行改造，降低免疫原性，同时将抗体由IgG2亚型更换为IgG1亚型，并在IgG1抗体重链CDR3与CH2区之间插入一段柔性氨基酸序列，达到降低ADCC/CDC功能的目的，提高抗体的稳定性，延长其半衰期。本发明专利技术的单抗与人C5结合的亲和力和原始Eculizumab抗体相近，可特异性地阻断C5补体溶血活性和C5a产生，可用于制备针对以C5为靶标的阵发性睡眠性血红蛋白尿及非典型溶血尿毒综合症的治疗药物，具有优异的临床治疗价值。

【技术实现步骤摘要】
低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗及其应用本申请要求申请日为2019年7月11日，申请号为201910623477.8，专利技术名称为“低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗及其应用”的中国专利申请的优先权。
本专利技术涉及治疗用工程抗体的制备及应用，主要是涉及针对人C5靶点的低免疫原性低ADCC/CDC功能的单抗及其应用。
技术介绍
Eculizumab能特异性地键合到人末端补体蛋白C5，通过抑制人补体C5向C5a和C5b的裂解以阻断炎症因子C5a的释放及C5b-9的形成。C5是在炎症反应中起重要作用的一种补体组分，在先天免疫防御中起重要作用，但是过分激活补体会导致严重的组织伤害。C5a是补体激活的重要产物之一，参与败血症、脓血症、急性肺损伤、过敏症及哮喘等许多炎症及自身免疫类疾病的发生与发展。使用C5a单抗阻断信号通路，可有效减轻炎症反应，为治疗炎症及自身免疫类疾病提供了新的思路。前体蛋白C5在C5转化酶的作用下裂解为C5a和C5b两个片段，补体系统活化产物C5a是一种过敏毒素，是炎症反应的重要介质和趋化因子；C5b则参与形成膜攻击复合物。C5a单抗具有三大适用范围：一是抑制机体急性反应，急性炎症，如急性肺损伤，；二是慢性的自身免疫性疾病，如治疗HS(化脓性汗腺炎)。“药物”阿达木，2017年销售了182亿美元，其有效性是10％，而C5a单抗的有效性超过80％；三是与PD-1联合使用，能够治疗肿瘤。Eculizumab单抗在宿主体内免疫原性较强，高达23％以上的患者使用该单抗会发生免疫反应，所述免疫反应可能引起免疫复合物介导的抗体或片段从循环中清除，并使反复投药不适用于治疗，从而降低对患者的治疗效益且限制抗体的再投予。基于此，若能够在不影响抗体亲和力和特异性的前提下，通过将抗体中高免疫原性的非抗原结合位点替换成低免疫原性的同源序列来降低抗体药的免疫原性，则一方面可使单抗的安全性得到提高；另一方面可增加药物半衰期，在减少其用剂量同时也能起到提高疗效的作用。同时，受限于其免疫原性的问题，Eculizumab单抗采用的是静脉注射的给药方式，药物通过静脉注射方式给药往往半衰期较短。因此，通过对免疫原性的改造可将给药方式转变为更加简易便捷的皮下注射，实现在患者在家中自助给药，并有效提升药物在体内的半衰期。目前未见低免疫原性C5抗体的报道。抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)是指表达IgGFc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。IgG抗体可介导这些细胞发挥ADCC作用，其中NK细胞是能发挥ADCC作用的主要细胞。在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞等效应细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，故抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。CDC指补体系统被激活后，在靶细胞表面形成MAC，导致靶细胞溶解，这种效应称为补体依赖的细胞毒作用。补体能导致多种细菌和其他病原生物细胞的溶解，是机体抵抗病原生物感染的重要防御机制。尤其是对防止革兰阴性菌的感染有重要作用。在某些病例情况下，补体系统可引起机体组织或细胞损伤，参与超敏反应和自身免疫病的致病过程。为了避免抗体结合靶蛋白后诱导不利的ADCC和CDC功能，目前普遍采取的方法为对抗体重链进行了298位氨基酸N突变成A的去糖基化突变或将抗体重链改为IgG4或IgG2亚型。原研型Eculizumab的氨基酸重链结构即采用了IgG2亚型。但是IgG2亚型抗体相比于IgG1亚型抗体结构较不稳定，易形成可溶性多聚体，半衰期显著缩短，且生产工艺较不成熟。这给临床患者的使用带来了风险和不便，同时药物半衰期也相对较短，使用的过程中也需要增大药物剂量来弥补该方面的缺陷。基于此，若能够在不影响抗体亲和力和特异性的前提下，通过对抗体恒定区域进行改造，在降低抗体免疫原性和ADCC/CDC功能的同时，将抗体IgG2亚型改为IgG1亚型，则一方面可使单抗的稳定性、安全性得到提高；另一方面可增加药物半衰期，在减少其用剂量同时也能起到提高疗效的作用。目前未见通过改动氨基酸序列来同时降低C5抗体免疫原性和ADCC/CDC功能的报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一类低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化的单抗。本专利技术的另一个目的在于提供一类制备低免疫原性、低ADCC/CDC治疗性抗体包括人源化抗C5的单克隆抗体的方法。本专利技术利用商业化的DNAStarTM软件对Alexion公司的Eculizumab单抗的原始氨基酸序列进行评价，结果显示，Eculizumab免疫原性系数为18。利用上述软件对抗体的可变区中的非抗原结合片段(FR)进行免疫原性评价，找到免疫原性强的相关序列。随后，查找人抗体基因库中所有涉及轻重链的FR区段，通过序列比对后选择出序列同源性高且免疫原性相对较低的区段。将所选框架区同Eculizumab中对应的区段进行替换，随后对替换后的序列进行3D建模，并同原研进行结构比对，选择保持同原研Eculizaumab构象相近的组合，利用Pymol软件对Eculizumab的结构进行分析，在抗体可变区与恒定区之间寻找相对柔性的区域，并在相应区域插入柔性氨基酸序列，对相应序列进行基因合成，测序，选择测序正确的序列用于后续的功能确证。对合成的基因进行测序同时选择测序正确的序列进行下一步操作，将轻链可变区设计酶切位点为HindIII+EcoRI，重链可变区设计酶切位点为HindIII+EcoRI，分别与表达载体pEE12.4(重链)及pEE6.4(轻链)载体连接，同时转化大肠杆菌DH5α，得到重链、轻链嵌合抗体表达载体。同时对构建的抗体进行测序和序列对比；对上述表达的载体进行质粒大提工作，选取Qiagen的无内毒素质粒大提试剂盒；对选取的质粒进行优化组合，同时利用CHO细胞进行瞬时转染表达，对表达的抗体进行亲和力和EC50检测根据检测结果来选定组合进行稳定株构建；根据上述检测结果，本专利技术选取相应的组合利用电转染方式构建稳定株，同时利用MTX进行抗体表达程度的筛选，对于加压后的稳定株进行单克隆筛选，最终挑选出抗体产量较高的稳定株。本专利技术在改造抗体框架区结构，降低抗体免疫原性的同时，也期望降低抗体的ADCC/CDC功能。通过在抗体重链的恒定区插入一段柔性序列，切断抗体可变区结合抗原后产生的机械应力传递，使抗体药重链恒定区与Fc受体和/或结补体合位点不能充分暴露出来，弱化抗体药与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等表达IgGFc受体的杀伤细胞结合或和补体结合，无法或降低诱导ADCC和CDC的信号。本专利技术还通过在ALEXION公司的Eculizumab抗体药的基础上将抗体亚型由IgG2变更为IgG1，同时在IgG1抗体重链CDR3与CH2区之间插入一段柔性氨基酸序列来阻断抗体结合抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗，其特征在于，对原始Eculizumab单抗氨基酸序列的重链可变区进行改造，通过将抗体由IgG2亚型更换为IgG1亚型，并在IgG1抗体重链CDR3与CH2区之间插入一段柔性氨基酸序列，所述原始Eculizumab单抗轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
20190711 CN 20191062347781.一种低免疫原性低ADCC/CDC功能的抗C5人源化单抗，其特征在于，对原始Eculizumab单抗氨基酸序列的重链可变区进行改造，通过将抗体由IgG2亚型更换为IgG1亚型，并在IgG1抗体重链CDR3与CH2区之间插入一段柔性氨基酸序列，所述原始Eculizumab单抗轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.如权利要求1所述的抗C5人源化单抗，其特征在于，所述柔性氨基酸序列包括GGGS，GGGSGGGS，GGSGGS。


3.如权利要求1所述的抗C5人源化单抗，其特征在于，其重链可变区含有SEQIDNO.3或4所示的氨基酸序列或SEQIDNO.3或4所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列，其轻链含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列或SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。


4.如权利要求1～3任一所述的抗C5人源化单抗，其特征在于，其重链含有SEQIDNO.5或6所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙乐，李茂华，任文林，
申请(专利权)人：京天成生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11