抗人血清白蛋白单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及经计算机分析人血清白蛋白成熟肽氨基酸序列，与鼠、牛、猴、羊、兔下去白蛋白成熟肽氨基酸序列比对，选择出多个人血清白蛋白特异抗原决定簇氨基酸序列短肽，短肽氨基酸长度分别为15‑35个。经人工合成短肽用于免疫小鼠，获得可产生不与鼠、牛、猴、羊、兔有免疫反应的特异抗人血清白蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞工程株。由细胞株制备的抗体对人血清白蛋白具有超高的灵敏度和超强的特异性。

【技术实现步骤摘要】
抗人血清白蛋白单克隆抗体
本专利技术属于生物
本专利技术涉及经计算机分析人血清白蛋白成熟肽氨基酸序列，与鼠、牛、猴、羊、兔下去白蛋白成熟肽氨基酸序列比对，选择出多个人血清白蛋白特异抗原决定簇氨基酸序列短肽，短肽氨基酸长度分别为15-35个。经人工合成短肽用于免疫小鼠，获得可产生不与鼠、牛、猴、羊、兔有免疫反应的特异抗人血清白蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞工程株。由细胞株制备的抗体对人血清白蛋白具有超高的灵敏度和超强的特异性。
技术介绍
人血清白蛋白（HSA）是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白（白蛋白前体）再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体（参见BrownJR，“Albuminstructure,Function,andUses”Pergamon,N.Y.，1977）。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90%的抗原性（与血浆中自然状态白蛋白相比），并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40-50克，其半衰期寿命为20天以上。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率,在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果（于在林、富岩，更优生物创新药-重组人血清白蛋白融合蛋白，中国医药生物技术，2017,12(3):248-264）。当人的尿液中检测到微量白蛋白，反映出肾脏可能有异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白检测指标可作为糖尿病、肾病疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿液中白蛋白定量检测，则具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法也具有重要的应用价值，而该方法的关键在于抗白蛋白单克隆抗体的灵敏度和特异性，即人血清白蛋白单克隆抗体，对抗原白蛋白检测灵敏度和特异性的高低，在临床上考察患者是否潜在患有糖尿病、肾病等慢性病的症状，这对于及早发现病情，及早治疗具有重要的临床意义。另一方面，鉴于血源人血清白蛋白采血采浆都遇到显著困难，而人白蛋白在临床上，又是治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化疗、腹水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等多种临床适应症的治疗药物。因此，利用微生物、植物，特别是毕赤酵母工程菌生产重组表达人血清白蛋白（rHSA）已成为血源HSA的升级换代在研产品。于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7和ZL2008中公开重组人血清白蛋白的表达工程菌的构建、生产工艺和纯化工艺。但重组人血清白蛋白的纯度要求更为严格。利用抗体/抗原具有特异性识别的特点而开展抗体亲和层析分离纯化，可进一步将重组人血清白蛋白的纯度大大提高（大大降低宿主蛋白残留量），纯化效率也会更高，这对于临床患者用药的安全性和经济性将具有非常重要的价值。抗人血清白蛋白单克隆抗体现已有市售的产品，但这些抗体虽具特异性，但在HSA上的结合位点都是不明的，而且价格昂贵，不能提供鼠杂交瘤细胞株。在用于人血清白蛋白纯化的抗体层析填料的制备，特别是大规模生产，要求一是抗体与人血清白蛋白的结合部位必须清楚，具特异性。而是大规模制备抗体要具成本低、简便，可重现的稳定性。这导致只有经本专利技术完成的技术路线，获得一个确知抗体抗原结合部位的抗人血清白蛋白鼠单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术是为了解决可规模化生产和制备一种抗人血清白蛋白的单克隆抗体，用于临床上检测样品中痕量人血清白蛋白的诊断试剂盒和制备可用于外源表达系统（酵母菌或植物）生产制备的重组人血清白蛋白的抗体亲和层析工具。本专利技术是按照以下技术方案实现的。专利技术人利用计算机分析软件，比较猴、鼠、兔、羊血清白蛋白与人血清白蛋白氨基酸序列的差异性，寻找在人血清白蛋白氨基酸序列中具特异性的抗原决定簇氨基酸序列短肽。人工合成这些短肽，分别将短肽用于免疫小鼠，通过腹水杂交瘤技术筛选出仅能产生与人血清白蛋白（HSA）发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，可与抗原HSA具有超高灵敏度和超强的免疫结合特异的能力。本专利技术中，通过小鼠免疫后，一种制备分泌特异强抗人血清白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征如下所述。1、经计算机选择出可能是抗原决定簇的人血清白蛋白氨基酸序列这，在筛选后，通过人工合成的多肽（短肽）氨基酸序列，分别是：SEQIDNo.FR1026:ENFKALVLIAFAQYLQ(16aa)SEQIDNo.FR1027:LLRLAKTYETTLEKCCAAAD(20aa)SEQIDNo.FR1028:CFAEEGKKLVAASQAALGL(19aa)每个短肽分别各合成10mg，其中10mg中的5mg短肽经化学偶联KLH。2、将200μg偶联KLH的短肽+弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，对小鼠实施基础免疫，方法是腹腔注射BalB/c小鼠，每次注射体积为0.2ml，每个短肽同时免疫5只小鼠。免疫抗原偶联KLH的短肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，做二次免疫为每隔2周腹腔注射1次，每次注射体积为0.2ml，偶联KLH的短肽用量为100μg/只。将免疫原偶联KLH的短肽与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，偶联KLH的短肽用量为100μg/只。3、二免后可适时经小鼠眼底采血，离心取血清后测小鼠免疫效果。具免疫反应的小鼠按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞按6:1的比例，用聚乙二醇制剂（PEG）进行融合；用HAT培养液选择培养。融合后7-14天，取细胞培养上清，采用间接ELISA方法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。4、重复进行数次亚克隆配合间接ELISA法进行筛选，就每一个人工合成HSA抗原决定簇短肽，都可获得至少一株分泌抗HSA的具特异性和高灵敏度单克隆抗体杂交瘤细胞株。5、短肽SEQIDNo.JN-1028获得的杂交瘤细胞的一个克隆细胞株（FR1028），其可分泌一种特异和高灵敏度抗人血清白蛋白单克隆抗体(mAb1028)，作为更优抗HSA单克隆抗体开展了进一步的应用。本专利技术中，一种杂交瘤细胞株可产生强抗人血清白蛋白的单克隆抗体，其特征在于是通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.经计算机分析人血清白蛋白氨基酸序列及空间构象，选择出可能具特异性表面抗原决定簇的氨基酸序列区域，经选择的氨基酸序列短肽人工合成，用于免疫小鼠，制备鼠免疫杂交瘤细胞，其可分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.经计算机分析人血清白蛋白氨基酸序列及空间构象，选择出可能具特异性表面抗原决定簇的氨基酸序列区域，经选择的氨基酸序列短肽人工合成，用于免疫小鼠，制备鼠免疫杂交瘤细胞，其可分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体。


2.根据权利要求1所述单克隆抗体，来自于人血清白蛋白表面抗原决定簇，选择抗原决定簇的氨基酸序列有SEQIDNo.FR1026、SEQIDNo.FR1027,以及SEQIDNo.FR1028。


3.根据权利要求1所述人工合成短肽，免疫小鼠后，经构建抗体表达鼠杂交瘤细胞株，产生抗人血清白蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体可与人血清白蛋白产生抗原抗特异反应，抗体为IgG1亚型抗体。


4.根据权利要求1所述的鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，优选地是mAb1026、mAb1027和mAb1028,更更优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：于在林，富岩，杨小楠，侯琼，富俞淞，陈颖，
申请(专利权)人：中美福源生物技术北京股份有限公司，天津溥瀛生物技术有限公司，北京美福源生物医药科技有限公司，天津林达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11