肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白-胶原结合域融合蛋白和应用制造技术

本发明专利技术提供了肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白‑胶原结合域融合蛋白和应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术利用HSA与CBD以不同分子结构形式形成基因融合，可在构建的重组工程宿主中获得表达，经规模化发酵制备，获得符合药用的重组融合蛋白。该重组融合蛋白有实体肿瘤瘤体特异靶向性，可应用于作为广谱性基质载体起始材料，与任何肿瘤治疗药物，小分子化合物或细胞毒性蛋白偶联后，可形成一种创新的药物复合物。本发明专利技术所述重组融合蛋白药物复合物还具长效性，可延长偶联药物在体内半衰期，在抗肿瘤上具显著优于单体药物的临床疗效。本发明专利技术还提供了所述药物复合物在制备实体肿瘤特异性靶向治疗的药物中的应用及制备相应的药物。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白-胶原结合域融合蛋白和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白-胶原结合域融合蛋白和应用。
技术介绍
人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14～20天。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的方法已在于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该重组融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率，在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果。人血清白蛋白还具有可非特异性地在实体肿瘤上聚集的功能。这是因为实体肿瘤为快速增生，肿瘤体就会大量增生微血管，来提供大量血液供应，白蛋白就造成在局部微血管中的聚集。利用白蛋白的这一特异功能，科学家研发出注射用紫杉醇(白蛋白结合型)，商品名：创新药(美国AmericanPharmaceuticalPartners,Inc.)，就是将紫杉醇与白蛋白偶联(coupling)而成。将紫杉醇与白蛋白偶联后，可大大降低紫杉醇的毒副反应，临床疗效显著。胶原结合域(CollagenBindingDomain，CBD)是人血管A型血友病因子vonWillebrandFactor(vWF)的一部分。vWF介导血小板向血管纤维胶原蛋白的粘附，在止血过程中起到了非常重要的作用。成熟的vWF蛋白含有2050个氨基酸，具有多个结构域，其中介导血小板凝结的是A3结构域，也是与纤维胶原结合的关键蛋白。vWF-A3结构域(也称为胶原结合域，CBD)是指成熟肽的920-1111之间的肽段，分子量20kDa。《HuizingaEG,MartijnVDPR,KroonJ,etal.CrystalstructureoftheA3domainofhumanvonWillebrandfactor:implicationsforcollagenbinding.[J].Structure,1997,5(9):1147.》，《BrondijkTHC,BihanD,FarndaleRW,etal.ImplicationsforcollagenIchainregistryfromthestructureofthecollagenvonWillebrandfactorA3domaincomplex.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2012,109(14):5253-8.》文章中详细讲述了vWFA3结构域与III型同源三聚体多肽胶原蛋白结合形成的晶体结构，进一步推断vWFA3结构域与I型异源三聚体的结合位点。III型同源三聚体胶原蛋白与vWFA3结构域结合位点和骨黏连蛋白及discodin结构域受体2部分重合。实体肿瘤为快速增生，肿瘤体就会大量增生微血管，需要大量血液供应，白蛋白就会在肿瘤体局部微血管中的聚集。这些微血管内壁有特异增生的纤维胶原体，也导致大大增强血管胶原可与vWF的胶原结合域紧密结合的机会。Sasaki等2019年8月[Sasakietal.,Sci.Adv.2019；5:1-12]曾发表利用小鼠血清白蛋白与胶原结合域融合，胶原结合域(CBD)通过连接肽与小鼠血清白蛋白的N端融合，并在融合蛋白的鼠血清白蛋白C末端添加了His-tag(6-His)，然后在脊椎动物细胞(HEK293F)中表达这种融合蛋白。但是该融合蛋白中的血清白蛋白非人源，CBD的C末端与鼠白蛋白的N端连接之间还设有1个连接肽，且在融合蛋白中还含有6His-标签，同时，文献中公开的融合蛋白制备是使用HEK293细胞，该表达细胞体系是非产业化用的细胞体系，且产量每L仅在μg-mg级间，如此获得的重组融合蛋白难于满足符合药用级/公斤(kg)级生产要求，且在生产成本上具相当显著的劣势。化疗药物作为小分子药物和毒性蛋白都是抑制肿瘤细胞生长和肿瘤瘤体萎缩的关键性临床治疗用药物。临床上熟悉的小分子化疗药物主要有铂类、亚硝脲类、抗叶酸类、抗嘧啶类、长春碱类、紫衫类、喜树碱类、蒽环类以及破坏DNA结构和功能的药物、嵌入DNA中干扰转录DNA的药物或影响蛋白质合成的药物等。临床上肿瘤细胞毒性蛋白优选包括有：蓖麻毒素、白喉毒素，天花粉蛋白凋亡素(Apotin)，又称VP3蛋白、铜绿假单胞菌外毒素、凋亡抑制家族蛋白(Survivin)、人表皮生长因子(EGF)、促性腺激素释放激素(gonadotrophinreleasinghormone,GnRH)以及脱氧核糖核苷酸酶II(DnaseII)等，都没有药物靶向性，临床需要的剂量非常高，具有非常显著的因非靶向性造成的全身性毒副反应，如果由实体肿瘤特异靶向性基质载体来携带上述小分子药物，则在临床毒性小分子药物使用剂量可大大降低，全身性化疗药物带来的毒副反应也会显著大大下降，研发全新的肿瘤治疗特异靶向性药物是现今最受关注的肿瘤治疗研究方向。蛋白质与小分子化合物化学偶联制备药物复合物的方法，是可用于本专利技术涉及到的重组融合蛋白与小分子化合物偶联目的，主要有直接偶联法。以白蛋白-紫杉醇结合(偶联)方法为例，将白蛋白储备液在室温条件下静置1h，取4ml的白蛋白储备液至离心管中，加入N1:N2＝9:1(N1为紫杉醇物质的量，N2为白蛋白物质的量)的紫杉醇储备液于离心管中，静置过夜，静置过夜后在3000rpm条件下离心20min。取上清液，经0.22μm滤膜过滤。上清液中还有紫杉醇-白蛋白复合物。如果制备复合物的纳米颗粒，可采用龚光明等报道的方法(Nanotechnology，22：295-603，2011；生物技术世界，2015，文章编号:1674-2060(2015)08-0164-01)来直接制备白蛋白药物化合物纳米颗粒，并与小分子化合物偶联。例如取100mg白蛋白，溶于10ml水后，37℃水浴，然后加入3-巯基-2-丁酮(终浓度为10μM)，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为在人血清白蛋白的N端或C端连接人胶原结合域。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为在人血清白蛋白的N端或C端连接人胶原结合域。


2.根据权利要求1所述重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为在所述人血清白蛋白的N端直接连接人胶原结合域，所形成的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为在所述人血清白蛋白的C端通过连接肽(GGGS)2与人胶原结合域连接，所形成的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求1所述重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为在人血清白蛋白的C端或N端通过连接肽(GGGS)2～5与人胶原结合域连接。


5.根据权利要求1～4任一项所述重组融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白的氨基酸序列还包括天...

【专利技术属性】
技术研发人员：于在林，富岩，杨小楠，富俞淞，乔国强，杨波，陈颖，
申请(专利权)人：中美福源生物技术北京股份有限公司，天津溥瀛生物技术有限公司，北京美福源生物医药科技有限公司，天津林达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11