本发明专利技术涉及一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，属于生物工程领域，解决了现有技术难以扩增得到全长RYR1基因，无法满足对于RYR1基因表达及功能的体外研究需要的问题。所示构建方法，包括将pcDNA3.1‑3Myc‑His质粒进行双酶切，得到线性化载体；获取小鼠RYR1基因片段，将基因片段分别连接到线性化载体中，构建含有基因片段的重组表达质粒；采用PCR扩增体系对含有基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到PCR产物，采用电泳回收PCR产物，得到扩增后的RYR1基因片段；通过无缝克隆的方式将扩增后的RYR1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
1、ryr1基因编码骨骼肌肌浆网上的i型兰尼碱受体，i型兰尼碱受体是由4个分子量约为560 kda的亚基组成的同源四聚体，调节肌浆网内钙离子的释放，参与骨骼肌兴奋-收缩偶联过程。ryr1基因的遗传性突变与恶性高热、横纹肌溶解、中央轴空病等一系列神经肌肉疾病有关。
2、ryr1基因编码哺乳动物体内最大的钙通道蛋白，编码ryr1蛋白氨基酸的mrna序列超过15kb。组织聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）是一种常用的分子生物学技术，近年来用于检测和放大组织样本中的特定dna或rna序列，方法操作方便、实验室污染风险低；但是尽管现有各种pcr技术不断升级改良，然而现有技术手段仍很难从复杂的基因组中特异性扩增出超大片段的dna，因而限制了对ryr1基因功能的研究；此外，随着合成生物学的不断发展，人类能够通过实验室手段在体外合成dna序列，但限于扩增能力不足，合成dna片段通常在3-4 kb，无法满足对于ryr1基因表达及功能的体外研究需要。因而，亟需提供一种ryr1基因表达质粒及其构建方法，可以用于全长ryr1基因的扩增。
技术实现思路
1、鉴于上述的分析，本专利技术实施例旨在提供一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒及其构建方法和应用，用以解决现有技术难以扩增得到全长ryr1基因，无法满足对于ryr1基因表达及功能的体外研究需要的问题。</p>2、本专利技术的目的主要是通过以下技术方案实现的：
3、本专利技术提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
4、s1：将pcdna3.1-3myc-his质粒通过hindiii和bamhi酶切质粒反应体系进行双酶切，得到线性化载体；
5、s2：获取小鼠ryr1基因片段ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d，将ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d分别连接到线性化载体中，分别构建含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒和含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒；
6、s3：采用pcr扩增体系对含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒、含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒进行扩增，得到pcr产物，采用电泳回收pcr产物，得到扩增后的ryr1基因片段；
7、s4：通过无缝克隆的方式将扩增后的ryr1基因片段连接到线性化载体上，构建得到全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒。
8、进一步地，步骤s2包括以下步骤：
9、s21：获取小鼠骨骼肌组织rna；
10、s22：小鼠骨骼肌组织rna逆转录合成小鼠骨骼肌组织cdna；
11、s23：以小鼠骨骼肌组织cdna为模板，将小鼠全长ryr1基因分成4段，分别为ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c和ryr1-d，经pcr反应分段扩增；
12、s24：通过同源重组的方式，分别将扩增后的ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c、ryr1-d基因片段，连接到步骤s1中得到的线性化载体中，构建分别含有ryr1-a、ryr1-b、ryr1-c、ryr1-d的重组表达质粒。
13、进一步地，步骤s23中，
14、所述ryr1-a基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.3所示；
15、所述ryr1-a基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.4所示；
16、所述ryr1-b基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.5所示；
17、所述ryr1-b基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.6所示；
18、所述ryr1-c基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.7所示；
19、所述ryr1-c基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.8所示；
20、所述ryr1-d基因片段pcr反应的上游引物序列如seq id no.9所示；
21、所述ryr1-d基因片段pcr反应的下游引物序列如seq id no.10所示。
22、进一步地，步骤s24中，
23、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.11所示；
24、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.12所示；
25、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.13所示；
26、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒序列如seq id no.14所示。
27、进一步地，步骤s3中，
28、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.15所示；
29、所述含有ryr1-a基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.16所示；
30、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.17所示；
31、所述含有ryr1-b基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.18所示；
32、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.19所示；
33、所述含有ryr1-c基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.20所示；
34、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒pcr反应的上游引物序列如seq idno.21所示；
35、所述含有ryr1-d基因片段的重组表达质粒pcr反应的下游引物序列如seq idno.22所示。
36、进一步地，步骤s4中，所述扩增后的ryr1基因片段包括用于同源重组的ryr1-a基因片段、用于同源重组的ryr1-b基因片段、用于同源重组的ryr1-c基因片段和用于同源重组的ryr1-d基因片段；
37、所述用于同源重组的ryr1-a基因片段序列如seq id no.23所示；
38、所述用于同源重组的ryr1-b基因片段序列如seq id no.24所示；
39、所述用于同源重组的ryr1-c基因片段序列如seq id no.25所示；
40、所述用于同源重组的ryr1-d基因片段序列如seq id no.26所示。
41、本专利技术还提供了一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒，根据上述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法得到，所本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S23中，
4.根据权利要求3所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S24中，
5.根据权利要求4所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S3中，
6.根据权利要求5所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤S4中，所述扩增后的RYR1基因片段包括用于同源重组的RYR1-A基因片段、用于同源重组的RYR1-B基因片段、用于同源重组的RYR1-C基因片段和用于同源重组的RYR1-D基因片段；
7. 一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒，根据权利要求1-6任一项所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到，其特征在于，所述全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒全长包括20599个碱基对，第1-10000位碱基如SEQ ID No.1所示，第10001-20599位碱基如SEQ ID No.2所示。
8.一种全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的应用，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒的构建方法得到的全长小鼠RYR1基因外源性表达质粒在研究恶性高热发病机制上的应用。
9.一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.一种RYR1-p.Arg2509Cys质粒在模拟人类恶性高热实验模型的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤s2包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤s23中，
4.根据权利要求3所述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤s24中，
5.根据权利要求4所述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤s3中，
6.根据权利要求5所述的全长小鼠ryr1基因外源性表达质粒的构建方法，其特征在于，步骤s4中，所述扩增后的ryr1基因片段包括用于同源重组的ryr1-a基因片段、用于同源重组的ryr1-b基因片段、用于同源重组的ryr1-c基因片段和用于...
【专利技术属性】
技术研发人员：于瑶，曲音音，郭向阳，李正迁，周阳，侯婷婷，童泽鑫，张译尹，冯路旸，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：
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