调节性多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及调节性多核苷酸，具体而言，本发明专利技术涉及调节性多核苷酸的组合物和制备、生产的方法以及治疗用途。的方法以及治疗用途。的方法以及治疗用途。

【技术实现步骤摘要】
调节性多核苷酸
[0001]本申请是申请号为201580073443.6，申请日为2015年11月13日，专利技术名称为“调节性多核苷酸”的中国专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2014年11月14日提交的标题为Modulatory Polynucleotides的美国临时专利申请号62/079,590、2015年8月31日提交的标题为Modulatory Polynucleotides的美国临时专利申请号62/212,004、2015年9月29日提交的标题为Modulatory Polynucleotides的美国临时专利申请号62/234,477的权益；它们中的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
[0004]对序列表的参考
[0005]本申请与电子形式的序列表一起提交。所述序列表作为2015年11月12日创建的标题为1014PCTSL.txt的文件提供，其大小为235,330字节。电子形式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。


[0006]本专利技术涉及用于设计、制备、生产和/或配制调节性多核苷酸的组合物、方法、工艺、试剂盒和装置。在某些实施方案中，这样的调节性多核苷酸可以由重组腺伴随病毒(AAV)编码或者在重组腺伴随病毒(AAV)内，且可以包含人工微RNA(microRNA)、人工前-微RNA(pre-microRNA)和/或人工初级-微RNA(pri-microRNA)。

技术介绍

[0007]微RNA(或miRNA或miR)是小的、非编码的、单链核糖核酸分子(RNA)，其经常是19-25个核苷酸的长度。已经在哺乳动物基因组中鉴别出超过1000种微RNA。成熟的微RNA主要通过部分地或完全地与靶mRNA的互补序列配对而结合靶信使RNA(mRNA)的3
’
非翻译区(3
’-
UTR)，从而在转录后水平促进靶mRNA的降解，且在某些情况下，抑制翻译的起始。微RNA在许多关键生物学过程(诸如细胞周期和生长的调节、细胞凋亡、细胞增殖和组织发育)中起关键作用。
[0008]miRNA基因通常被转录为miRNA的长初级转录物(即初级-miRNA(pri-miRNA))。初级-miRNA被切割成miRNA的前体(即前-miRNA(pre-miRNA))，其被进一步加工以产生成熟的和功能性的miRNA。
[0009]尽管许多靶标表达策略采用基于核酸的模态(modality)，仍然需要改进的具有更高特异性且具有更少脱靶效应的核酸模态。
[0010]本专利技术提供了呈人工初级-、前-和成熟的微RNA构建体的形式的这样的改进的模态以及它们的设计方法。这些新颖的构建体可以是合成的独立分子，或者在用于递送至细胞的质粒或表达载体中编码。这样的载体包括但不限于腺伴随病毒载体诸如任一种AAV血清型的载体基因组，或其它病毒递送媒介物诸如慢病毒等。

技术实现思路

[0011]本文描述了用于设计、制备、生产和/或配制调节性多核苷酸的组合物、方法、工艺、试剂盒和装置。
[0012]在某些实施方案中，这样的调节性多核苷酸可以由质粒或载体或重组腺伴随病毒(AAV)编码或者被包含在质粒或载体或重组腺伴随病毒(AAV)内，且可以包含人工微RNA、人工前-微RNA和/或人工初级-微RNA。
[0013]在下面的描述中阐述了本专利技术不同实施方案的细节。从描述和附图以及从权利要求书中会明白本专利技术的其它特征、目的和优点。
附图说明
[0014]从附图所示的本专利技术的特定实施方案的以下描述会明白前述和其它目标、特征和优点，在附图中，在不同的视图中相同的附图标记表示相同的部件。附图不一定按比例，而是将重点放在解释本专利技术的各个实施方案的原理。
[0015]图1是根据本专利技术在AAV载体中编码的人工初级-微RNA的示意图。
[0016]图2的直方图显示了在AAV载体中编码的初级-mRNA构建体的活性。
[0017]图3的直方图显示了在AAV载体中编码的调节性多核苷酸的引导链在HEK293T细胞中的活性。
[0018]图4的直方图显示了在AAV载体中编码的调节性多核苷酸的过客链在HEK293T细胞中的活性。
[0019]图5的直方图显示了在AAV载体中编码的调节性多核苷酸的引导链在HeLa细胞中的活性。
[0020]图6的直方图显示了在AAV载体中编码的调节性多核苷酸的过客链在HeLa细胞中的活性。
[0021]图7是表达的细胞内AAV DNA的定量的直方图。
[0022]图8的直方图显示了在AAV载体中编码的构建体在人运动神经元中的活性。
[0023]图9的图显示了U251MG细胞中的剂量依赖性的SOD1沉默。
[0024]图10的图显示了人星形胶质细胞中的剂量依赖性的SOD1沉默。
[0025]图11的图显示了在U251MG细胞中SOD1沉默的时程。
[0026]图12包含图12A、图12B和图12C，它们是显示构建体的剂量依赖性作用的图。图12A显示了相对SOD1表达。图12B显示了引导链的百分比。图12C显示了过客链的百分比。
[0027]图13的简图显示了调节性多核苷酸(MP)相对于ITR、内含子(I)和聚腺苷酸(P)的位置。
具体实施方式
[0028]本专利技术的组合物
[0029]根据本专利技术，提供了作为人工微RNA起作用的调节性多核苷酸。本文中使用的“调节性多核苷酸”是起作用以调节(增加或降低)靶基因的水平或量的任何核酸聚合物。调节性多核苷酸包括在调节之前在细胞内加工的前体分子。调节性多核苷酸或其加工形式可以在质粒、载体、基因组或用于递送至细胞的其它核酸表达载体中编码。
[0030]在某些实施方案中，将调节性多核苷酸设计为初级微RNA(初级-miR)或前体微RNA(前-miR)，它们在细胞内加工以产生高度特异性的人工微RNA。
[0031]基于经典的(canonical)或已知的微RNA、初级-微RNA或前-微RNA的序列或结构支架，可以设计调节性多核苷酸，特别是本专利技术的人工微RNA。这样的序列可以对应任何已知的微RNA或它的前体，诸如在美国公开US2005/0261218和美国公开US2005/0059005(其内容通过引用整体并入本文)中教导的那些。
[0032]微RNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其结合核酸分子的3
′
UTR并下调基因表达(通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译)。本专利技术的调节性多核苷酸可以包含一种或多种微RNA序列、微RNA种子或人工微RNA，例如，作为微RNA起作用的序列。
[0033]微RNA序列包含“种子”区域，即，在成熟的微RNA的位置2-9的区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微RNA种子可以包含成熟的微RNA的位置2-8或2-7或2-9。在某些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调节性多核苷酸，其包含(a)茎和环，其形成茎-环结构，所述茎-环结构的序列从5
’
至3
’
包含：(i)5
’
茎臂，所述5
’
茎臂包含过客链和5
’
间隔序列，其中所述5
’
间隔序列位于所述过客链的5
’
；(ii)环区域，其长度介于4-20个核苷酸；(iii)3
’
茎臂，所述3
’
茎臂包含引导链和3
’
间隔序列，其中所述3
’
间隔序列位于所述引导链的3
’
；(b)位于所述过客链5
’
的第一侧接区域，所述第一侧接区域包含所述5
’
间隔序列和5
’
侧接序列；和(c)位于所述引导链3
’
的第二侧接区域，所述第二侧接区域包含所述3
’
间隔序列和3
’
侧接序列，并且其中所述第二侧接区域包含与SEQ ID NO:11的核苷酸1-35具有至少90％同一性的核苷酸序列；其中引导链序列包含与SEQ ID NO:449的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少18个连续核苷酸；并且其中过客链序列包含与SEQ ID NO:448的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少18个连续核苷酸。2.根据权利要求1所述的调节性多核苷酸，其中所述第一侧接区域包含与SEQ ID NO:2的核苷酸25-54具有至少90％同一性的核苷酸序列。3.一种调节性多核苷酸，其包含(a)茎和环，其形成茎-环结构，所述茎-环结构的序列从5
’
至3
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包含：(i)5
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茎臂，所述5
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茎臂包含引导链和5
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间隔序列，其中所述5
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间隔序列位于所述引导链的5
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；(ii)环区域，其长度介于4-20个核苷酸；(iii)3
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茎臂，所述3
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茎臂包含过客链和3
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间隔序列，其中所述3
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；(b)位于所述引导链5
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的第一侧接区域，所述第一侧接区域包含所述5
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间隔序列和5
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的第二侧接区域，所述第二侧接区域包含所述3
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间隔序列和3
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侧接序列，并且其中所述第二侧接区域包含与SEQ ID NO:11的核苷酸1-35具有至少90％同一性的核苷酸序列；其中引导链序列包含与SEQ ID NO:449的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少18个连续核苷酸；并且其中过客链序列包含与SEQ ID NO:448的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少18个连续核苷酸。4.根据权利要求3所述的调节性多核苷酸，其中所述第一侧接区域包含与SEQ ID NO:2的核苷酸25-54具有至少90％同一性的核苷酸序列。5.一种调节性多核苷酸，其包含(a)茎和环，其形成茎-环结构，所述茎-环结构的序列从5
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至3
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包含：(i)5
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茎臂，所述5
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茎臂包含过客链和5
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间隔序列，其中所述5
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间隔序列位于所述过客链的5
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；(ii)环区域，其长度介于4-20个核苷酸；
(iii)3
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茎臂，所述3
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茎臂包含引导链和3
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间隔序列，其中所述3
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间隔序列位于所述引导链的3
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；(b)位于所述过客链5
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的第一侧接区域，所述第一侧接区域包含所述5
’
间隔序列和5
’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯金兆，M，
申请(专利权)人：沃雅戈治疗公司，
类型：发明
国别省市：