结合前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术涉及包含特异性结合PSMA抗原的抗原结合片段的新型嵌合抗原受体(CAR)，以及通过用它转染和/或转导T细胞制备高质量CAR T细胞产物的方法，其允许单独或与药物，例如化学疗法，生物药物，例如抗体或小分子药物，例如蛋白激酶抑制剂组合在体内根除肿瘤。白激酶抑制剂组合在体内根除肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体
[0001]本专利技术涉及结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体，其中该抗原是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。将嵌合抗原受体(以下为CAR)带入免疫细胞，特别是T细胞，NK细胞，iNKT细胞和CIK细胞中，然后它们与表达PSMA的肿瘤细胞特异性反应，从而导致肿瘤细胞的消除。本专利技术的构建体含有两个主要部分。在一方面是特异性结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗原结合区，而另一方面是源自免疫细胞受体负责信号转导和激活免疫细胞的共刺激域。
[0002]前列腺癌仍然是全世界男性中第二常被诊断出的癌症，每年估计有110万新病例。此外，预计有307,000例死亡，它代表癌症死亡的第五大原因。尽管原发性肿瘤可以成功治疗，但尚无晚期阶段的治愈性治疗。因此，迫切需要新的治疗选择。
[0003]前列腺特异性膜抗原(PSMA)是前列腺癌中用于基于抗体的诊断和治疗干预的最佳表征的抗原。该蛋白质也称为谷氨酸羧肽酶II(EC 3.4.17.21)，N-乙酰基连接的酸性二肽酶I(NAALADase)或叶酸水解酶。PSMA是一种II型膜糖蛋白，其由750个氨基酸(aa)组成，具有19aa的小胞内域，24aa的跨膜域和707aa的大胞外域。胞外域折叠成三个不同的域：蛋白酶域(aa 57
–
116和352
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590)，顶端域(aa 117
–
351)和C端域(aa 591
–
750)。它显示出与人转铁蛋白受体1的高度结构相似性和同一性。PSMA高度局限于前列腺癌细胞的表面，在所有肿瘤阶段期间存在于癌细胞上，并且在雄激素非依赖性和转移性疾病中表达增强。PSMA不分泌到胞外空间中，并且经历组成型内在化，这通过PSMA特异性抗体的结合而增强。这些特征使其成为晚期前列腺癌的靶向治疗的理想候选者。此外，还发现PSMA实际上在所有实体瘤类型的新生血管内皮中表达而在正常血管内皮中不表达。因此，它被认为是独特的抗血管生成靶标。
[0004]单克隆抗体(mAb)是用于细胞靶向的高度特异性且用途广泛的工具。在过去的几十年中，它们在医学研究中引起了高度兴趣，并已成为发展最快的一类治疗多种人类疾病的药物，所述疾病包括癌症。抗体7E11是第一个发布的PSMA特异性mAb，并且被发现与PSMA胞内域的N端(MWNLLH)结合。7E11的标签内(In-labeled)形式(ProstaScint,Cytogen,Philadelphia,PA)已获得美国食品药品管理局(FDA)的批准，用于软组织中转移性前列腺癌的检测和成像。但是，由于抗体结合胞内表位，因此7E11无法结合活细胞。使用ProstaScint进行体内成像的阳性信号只得追溯到检测到肿瘤块内死亡或垂死的细胞。因此，产生了一类新的抗-PSMA mAb，其特异性结合活细胞表达的PSMA的胞外表位。
[0005]EP 1 883 698公开了三种不同的mAb 3/A12、3/E7、3/F11，它们显示出与前列腺癌细胞和前列腺组织标本表面上的PSMA的细胞外部分的强特异性结合。与经过临床验证的放射免疫疗法抗体mAb J591(PMID:18552139；PMID:24135437；PMID:25771365；PMID:26175541)直接比较，mAb 3/F11与表达PSMA的C4-2前列腺癌靶细胞具有更高的结合力(3/F11的K
d
[定义为平均半最大饱和浓度]＝9nM；J591的K
d
＝16nM)。此外，竞争性结合研究表明，mAb 3/F11与J591(PMID:19938014)结合不同的胞外PSMA表位。在一组人体正常组织的免疫组织学研究中，检测不到3/F11 mAb与PSMA阴性组织(肾上腺、骨髓、小脑、大脑、垂体、结肠、食道、心脏、肾脏、肝脏、肺、心包的间皮细胞、神经、卵巢、胰腺、骨骼肌、皮肤、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体和子宫)的结合。仅观察到与唾液腺分泌细胞和十二指肠刷状缘
细胞的结合，已知它们表达PSMA(PMID：19938014)。mAb 3/F11对所有测试的正常前列腺组织的腺泡分泌上皮细胞显示中等免疫反应性。几乎在腺癌的所有上皮细胞以及淋巴结转移中都观察到了更强烈且广泛的染色。在乳腺标本的冷冻切片上未检测到免疫组织学染色。相反，根据其他已发表的数据，用mAb J591检测到乳腺导管上皮的染色。由于通过PCR或者通过Western印迹法都检测不到乳腺组织中的PSMA表达，因此mAb J591可能与另一种抗原发生交叉反应。
[0006]通过噬菌体展示技术从mAb 3/F11产生单链可变片段(scFv)D7(如EP 1 883 698 B1中所公开)。对于抗PSMA scFv的特异性最重要的片段是V
L
和V
H
部分，它们优选用聚甘氨酸接头相连。D7以约18nM的K
d
与表达PSMA的C4-2细胞结合，并且与亲本mAb 3/F11的预温育完全抑制结合活性。这证明scFv D7与3/F11结合相同的PSMA表位。scFv D7及其人源化形式已成功用于构建基于假单胞菌外毒素A(PE)的免疫毒素，该免疫毒素对表达PSMA的前列腺癌细胞表现出高且特异性的细胞毒性，并且在携带前列腺肿瘤的小鼠中显示体内抗肿瘤活性。
[0007]根据本专利技术，D7 scFv用于构建嵌合抗原受体(CAR)以提供用于免疫细胞中以靶向表达PSMA的癌细胞的构建体。
[0008]Ma等人[The Prostate(2014)74,pp 286-296]公开了针对PSMA的第二代CAR，其包含CD28共刺激域和CD3ζ信号传导域以及来自小鼠抗人PSMA单克隆抗体3D8的抗原结合部分，所述单克隆抗体3D8可购自Northwest Biopharmaceutics,Inc。
[0009]Santoro等人[Cancer Immunol.Res.(2015),pp 68-84]描述了带有针对前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体的T细胞，其中PSMA结合部分源自抗体J591。
[0010]Zhong等人[Molecular Therapy(2010),pp.413-420]还公开了嵌合抗原受体，其中PSMA结合片段也源自抗体J591。J591的序列是本领域公知的。WO 2009/017823公开了其VH和VL域。
[0011]提供了抗原结合片段D7的氨基酸序列(图10；SEQ ID NO:1)和核酸序列(SEQ ID NO:8)，包括编码所述构建体的互补链(SEQ ID NO:9)。此外，显示并用灰色箭头突出显示抗原结合片段的高度重要的部分，即CDR：(CDR-H1(SEQ ID NO:2)，CDR-H2(SEQ ID NO:3)，CDR-H3(SEQ ID NO:4)，CDR-L1(SEQ ID NO:5)，CDR-L2(SEQ ID NO:6)和CDR-L3(SEQ ID NO:7))。
[0012]鼠抗体的人源化涉及将有益特性(例如抗原特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含特异性结合PSMA抗原的抗原结合片段的嵌合抗原受体，其中针对PSMA的所述抗原受体源自单链可变片段D7，跨膜域，特别是CD3ζ胞质域和胞内信号传导域，特别是CD28和/或4-1BB胞质域。2.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其特征在于它含有至少三个选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的CDR，或者在于它含有至少四个选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的CDR，或者在于它含有至少五个选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的CDR，或者在于它含有至少六个选自下组的CDR：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。3.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其特征在于所述抗原结合片段是人源化的。4.根据权利要求3的嵌合抗原受体，其特征在于它源自单链可变片段D7。5.根据权利要求3或4的嵌合抗原受体，其特征在于它包含氨基酸序列：ARDGNFPYYAMDSW。6.根据权利要求3或4的嵌合抗原受体，其特征在于它包含氨基酸序列：SQSTHVPT。7.编码根据权利要求1至6中任一项的嵌合抗原受体的核酸，其特征在于它含有编码根据权利要求1至6中任一项的嵌合抗原受体的核酸。8.编码根据权利要求1-6中任一项的嵌合抗原受体的载体，其特征在于它含有编码根据权利要求1-7中任一项的嵌合抗原受...

【专利技术属性】
技术研发人员：T卡托门，J阿尔祖比，V德特默，P沃尔夫，S舒尔策西曼，I库克库克，H阿布肯，J库勒，
申请(专利权)人：艾伯特路德维格斯弗赖堡大学，
类型：发明
国别省市：