一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本申请公开了一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达。本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，能够与天然GPC1蛋白结合，可用于检测GPC1蛋白的表达，对胰腺癌进行早期诊断，为胰腺癌的早期诊断筛查提供了一种新的可选方案。腺癌的早期诊断筛查提供了一种新的可选方案。腺癌的早期诊断筛查提供了一种新的可选方案。

【技术实现步骤摘要】
一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及胰腺癌检测领域，特别是涉及一种抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胰腺癌是一种病因及发病机制至今不明的高度恶性的消化系肿瘤，其临床症状隐匿，发展迅速，预后极差。在全球范围内，胰腺癌的发病率呈逐渐上升趋势，2014年，美国胰腺癌术后5年生存率＜6％，在恶性肿瘤病死率中居第4位。我国肿瘤流行病学调查显示，2011年胰腺癌在恶性肿瘤病死率中占第7位，而2015年我国胰腺癌死亡率上升至第6位。过去的20年里，胰腺癌的治疗没有取得实质性进步。由于胰腺癌早期无特异性临床症状及体征，大多数患者诊断时已失去手术切除最佳时期，因此，如何提高胰腺癌的早期诊断率一直是肿瘤临床所面临的艰巨任务。近年来，随着生物技术的迅速发展和基因组学、蛋白组学的诞生，大量肿瘤标志物的应用使得胰腺癌的早期诊断成为了现实。相对于影像学而言，血清中的标志物具有更高的敏感性和前瞻性，可在病变部位发生影像学改变之前表现出显著的变化，可有效弥补影像学诊断的滞后性。
[0003]外泌体(exosomes)是大多数细胞都能分泌的一种微小囊泡，直径大约在40-100nm。外泌体在1983年首次被发现，但仅被认为是细胞排泄的一种方式，如今，随着对外泌体研究的不断深入，发现其携带大量特异性蛋白、脂质、核酸等生物信息分子，在细胞间通讯起着重要的作用。由于外泌体在体液中的稳定性以及能够被有效分离的特性，在研究癌症相关的早期检测标志物方面具有巨大潜力。
[0004]2015年发表在nature上的一篇文章(Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer)发现在胰腺癌患者的血清外泌体中显著高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)，而相比之下胰腺炎、良性胰腺病变和正常对照组中的血清外泌体GPC1的表达水平较低，这提示GPC1可能作为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物，因此，设计一种针对GPC1的抗体可用作胰腺癌早期诊断。

技术实现思路

[0005]本申请的目的是提供一种新的抗人胰腺癌单克隆抗体及其制备方法和应用。
[0006]本申请采用了以下技术方案：
[0007]本申请的一方面公开了一种抗人胰腺癌单克隆抗体，该抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达。
[0008]需要说明的是，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达获得；其中，Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK，是本申请采用流式细胞分选法筛选得到抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的单个B细胞克隆，然后以单个B
细胞起始扩增天然配对的抗体重轻链序列，再按照人细胞表达系统的偏爱性对扩增出的重轻链基因进行密码子优化，最终根据优化的密码子获得的重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列。因此，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体可以与天然GPC1结合，可以用于检测GPC1蛋白的表达，对胰腺癌进行早期诊断和筛查。
[0009]可以理解，本申请的关键在于重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列的研究，至于具体如何表达，可以参考现有的重链轻链克隆表达系统和方法。
[0010]优选的，克隆表达采用的载体为商品化的哺乳细胞表达载体。
[0011]优选的，克隆表达采用的载体为pFUSE-mouse Fc。
[0012]需要说明的是，pFUSE-mouse Fc只是本申请的一种实现方式中证实可行的一种哺乳细胞表达载体，不排除还可以采用其它的克隆表达载体。
[0013]本申请的另一面公开了一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的克隆质粒，该克隆质粒中含有Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK。
[0014]优选的，克隆质粒为商品化的哺乳细胞表达载体。更优选为，pFUSE-mouse Fc。
[0015]需要说明的是，本申请的关键在于研发获得了重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列，根据该配对的重轻链序列，可以克隆表达获得本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体；因此，克隆有本申请重链序列-GPC1-VH序列和轻链序列-GPC1-VK序列的克隆质粒可以单独作为一个产品使用或售卖。
[0016]本申请的再一面公开了一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的人工合成核酸，该人工合成核酸包括Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸。
[0017]需要说明的是，本申请的Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸，这两个核酸作为一组独立的产品，也可以单独使用或售卖；至于后续的表达载体和表达体系可以参考现有的载体构建和表达。
[0018]本申请的再一面公开了本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，或者本申请的克隆质粒，或者本申请的人工合成核酸在制备胰腺癌检测试剂盒或装置中的应用。
[0019]需要说明的是，本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，其作用就是用于胰腺癌检测，因此，可以制成相应的胰腺癌特异性检测试剂盒，用于胰腺癌的早期诊断或筛查；当然，试剂盒中还可以包括其它免疫检测相关的试剂，在此不作具体限定。基于本申请抗人胰腺癌单克隆抗体对胰腺癌的检测原理，同样可以将本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体制成相应的检测装置，例如层析试纸条或类似的结构装置。本申请的克隆质粒和人工合成核酸，能够制备出本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体，因此，同样可以用于制备胰腺癌检测试剂盒。
[0020]本申请的再一面公开了本申请的抗人胰腺癌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，
[0021]B细胞筛选步骤，包括对获取的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫的动物的外周血单核细胞进行细胞染色，并采用流式细胞仪对染色的细胞进行筛选，获得单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞；
[0022]抗体序列扩增步骤，包括对获得的单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞进行裂解和逆转录，并采用抗体扩增引物对逆转录产物进行PCR扩增；
[0023]抗体序列克隆和测序验证步骤，包括对PCR扩增产物进行回收，并与pMD载体连接，转入感受态大肠杆菌细胞中，用于含氨苄青霉素的LB固体培养基进行筛选培养，挑选单克隆菌落在培养液中进行培养，然后对菌液进行Sanger测序，验证抗体序列的准确性以及是否含有重链和轻链配对信息；
[0024]密码子优化步骤，根据Sanger测序结果，按照本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人胰腺癌单克隆抗体，其特征在于：所述抗人胰腺癌单克隆抗体由Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK克隆表达。2.根据权利要求1所述的抗人胰腺癌单克隆抗体，其特征在于：所述克隆表达采用的载体为商品化的哺乳细胞表达载体；优选为，pFUSE-mouse Fc。3.一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的克隆质粒，其特征在于：所述克隆质粒中含有Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK。4.根据权利要求3所述的克隆质粒，其特征在于：所述克隆质粒为商品化的哺乳细胞表达载体；优选为，pFUSE-mouse Fc。5.一种用于制备抗人胰腺癌单克隆抗体的人工合成核酸，其特征在于：所述人工合成核酸包括Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH核酸和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK核酸。6.根据权利要求1或2所述的抗人胰腺癌单克隆抗体，或者权利要求3或4所述的克隆质粒，或者权利要求5所述的人工合成核酸在制备胰腺癌检测试剂盒或装置中的应用。7.根据权利要求1或2所述的抗人胰腺癌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，B细胞筛选步骤，包括对获取的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫的动物的外周血单核细胞进行细胞染色，并采用流式细胞仪对染色的细胞进行筛选，获得单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞；抗体序列扩增步骤，包括对获得的单个的抗人胰腺癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的B细胞进行裂解和逆转录，并采用抗体扩增引物对逆转录产物进行PCR扩增；抗体序列克隆和测序验证步骤，包括对PCR扩增产物进行回收，并与pMD载体连接，转入感受态大肠杆菌细胞中，用于含氨苄青霉素的LB固体培养基进行筛选培养，挑选单克隆菌落在培养液中进行培养，然后对菌液进行Sanger测序，验证抗体序列的准确性以及是否含有重链和轻链配对信息；密码子优化步骤，根据Sanger测序结果，按照人细胞表达系统的偏爱性对扩增出的重链和轻链基因进行密码子优化，获得Seq ID No.1所示的重链序列-GPC1-VH和与之配对的Seq ID No.2所示的轻链序列-GPC1-VK；抗人胰腺癌单克隆抗体表达步骤，将合成的重链序列-GPC1-VH和轻链序列-GPC1-VK克隆到商品化的哺乳细胞表达载体中，表达出的抗体即所述抗人胰腺癌单克隆抗体。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫的动物的外周血单核细胞的制备方法包括，采用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1和弗氏佐剂的混合液对健康的兔子进行皮下多点注射免疫，至少进行四次免疫后，采集兔耳缘静脉血，采用小型哺乳动物淋巴细胞分离试剂液对兔耳缘静脉血进行分离，获得所述外周血单核细胞；优选的，所述细胞染色包括，采用异硫氰酸荧光素对GPC1抗原进行标记，然后采用异硫氰酸荧光素标记的GPC1抗原对外周血单核细胞进行染色。9.根据权利要求7或所述的制备方法，其特征在于：所述逆转录采用的引物为TSO引物和oligo-dT引物，所述抗体扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄谧，马莹莹，丁权，李新洋，刘楚新，杨乃波，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：