【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体，具体涉及cd3特异性抗体及其制备方法和相关应用。
技术介绍
1、t淋巴细胞是机体发生免疫应答反应的重要的免疫细胞，是机体发生免疫反应的重要组成部分，在特异性抗原刺激下通过分泌细胞因子产生相应的免疫应答反应(amin,2016；morrow et al.,2019；zhu et al.,2019)。cd3是t淋巴细胞的分化抗原之一，在免疫反应中，cd3与t细胞受体(t cell receptor，tcr)通过非共价键形成tcr/cd3复合体，参与细胞的信号传导、分化、增殖及发挥效应等过程(malissen et al.,1993)。cd3蛋白由cd3γ、cd3δ、cd3ε(cd3e)、cd3ζ、cd3η五种亚基构成，其中cd3e是cd3蛋白的重要组成部分，由1个免疫球蛋白样的胞外域和1个免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，itam)组成。研究表明cd3ε基因的缺失可导致机体产生严重的免疫缺陷。
2、随着生物技术的不断进步和对疾病机制研究的不断深入，抗体在肿瘤、自身免疫疾病、心血管病、多发性硬化症等诸多适应症方面都带来了新的治疗突破。okt3(orthokung t3,murine igg2a)是第一个获得fda批准的治疗性单克隆抗体，开创了单克隆抗体用于疾病治疗的先河。okt3通过与t淋巴细胞表面cd3蛋白结合，阻断t细胞活化，发挥免疫抑制功能，被用于治疗肾移植中的同种异体排斥反应(woodle et al.,1999
3、抗体分子根据其构型可分为传统抗体和重链抗体(heavy-chain-only antibody，hcab)。传统单克隆抗体是由四条肽链组成的对称结构，包含两条轻链和两条重链，重链和轻链之间通过二硫键连接。传统单克隆抗体分子大、结构复杂、开发价格昂贵(banta etal.,2013)。因此，设计和开发下一代小型化抗体已成为基因工程抗体的主要研究目标之一。1993年，比利时科学家hamers等在骆驼科动物体内发现了一种不同于传统抗体的天然缺失轻链的抗体，被称为重链抗体。重链抗体的单体由两个恒定区(ch2和ch3)、一个铰链区和一个重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，vhh)组成(hamers c et al.,1993)。重链可变区(vhh)具有与全长抗体相当的结构稳定性及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位(feige et al.,2014)。这种单域抗体(single-domain antibody，sdab)的直径仅2.5nm，长4nm，相对分子质量仅12～15kda，因此又被称为纳米抗体(nanobody，nb)(cortez-retamozo et al.,2004)。与传统抗体相比，纳米抗体具有多种优势，例如，具有较好的结构稳定性和极高的溶解性(li etal.,2015)；具有较长的互补决定区(complementarity determining region，cdr)，能够结合一些抗原上的隐蔽表位；其较小的分子量使其具有较强的组织穿透能力，能够到达组织内部；其无需轻链配对，因此不像来自传统抗体的单链抗体(single-chain fragmentvariable，scfv)容易发生粘连；其缺少复杂的糖基化位点，因此可以利用大肠杆菌和酵母进行高效表达制备(liu et al.,2018；liu and huang,2018；osaki et al.,2018)。虽然来源于驼科动物，但其与人类重链v区基因的同源性高达80％-90％；其重链可变区(vhh)不含fc(fragment crystallizable)段，使得对其进行人源化改造简单易行(vincke et al.,2009)。包括cd3靶点在内的免疫治疗研究是近年来的热门领域，开展靶向cd3的纳米抗体研发具有巨大的应用前景。因此，开发我国国产化、高效特异的cd3纳米抗体，具有积极深远的意义。
技术实现思路
1、如前所述，本领域需要一种cd3特异性抗体。
2、本专利技术使用人cd3ε胞外域作为免疫原进行羊驼免疫后，获得羊驼外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)，从pbmc中分离纯化淋巴细胞，提取淋巴细胞的rna，经过cdna合成、扩增获得重链抗体的重链可变区(vhh)，利用噬菌体展示技术获得vhh噬菌体展示文库；利用辅助噬菌体对vhh噬菌体展示文库进行扩增和拯救，筛选cd3特异性纳米抗体阳性克隆，并通过测序获得候选单克隆抗体的基因序列信息，使用优化的原核表达系统对cd3纳米抗体进行大量表达和亲和纯化，获得与细胞表面的cd3复合物有较好结合能力的cd3纳米抗体。由此，实现了本专利技术。
3、在第一方面，本专利技术提供了一种cd3特异性抗体，包括：
4、vhh1:seq id no:2所示的vh cdr1、seq id no:4所示的vh cdr2、和seq id no:6所示的vh cdr3，
5、vhh2:seq id no:9所示的vh cdr1、seq id no:11所示的vh cdr2、和seq id no:13所示的vh cdr3，
6、vhh3:seq id no:16所示的vh cdr1、seq id no:18所示的vh cdr2、和seq id no:20所示的vh cdr3，
7、vhh4:seq id no:23所示的vh cdr1、seq id no:25所示的vh cdr2、和seq id no:27所示的vh cdr3，
8、vhh5:seq id no:30所示的vh cdr1、seq id no:32所示的vh cdr2、和seq id no:34所示的vh cdr3，
9、vhh6:seq id no:37所示的vh cdr1、seq id no:39所示的vh cdr2、和seq id no:41所示的vh cdr3，
10、vhh7:seq id no:44所示的vh cdr1、seq id no:46所示的vh cdr2、和seq id no:48所示的vh cdr3，
11、vhh8:seq id no:51所示的vh cdr1、seq id no:53所示的vh cdr2、和seq id no:55所示的vh cdr3，
12、vhh本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CD3特异性抗体，包括：
2.根据权利要求1所述的CD3特异性抗体，还包括：
3.根据权利要求1或2所述的CD3特异性抗体，其中所述CD3特异性抗体为纳米抗体。
4.根据权利要求1或2所述的CD3特异性抗体，其中所述CD3特异性抗体为还包括恒定区CH2和CH3以及铰链区的重链抗体；优选地，所述重链抗体为人源化的嵌合抗体，包括人源IgG1的恒定区CH2和CH3以及铰链区。
5.一种核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的CD3特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括：
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述核酸分子还包括：
8.一种表达载体，包含权利要求5-7中任一项所述的核酸分子；优选地，所述表达载体是质粒，如pMECs系列质粒、pcDNA质粒如pcDNA3.1质粒。
9.一种表达细胞，包含权利要求5-7中任一项所述的核酸分子或者权利要求8所述的表达载体；优选地，所述表达细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞，如WK6、BL21、TG1。
<...【技术特征摘要】
1.一种cd3特异性抗体，包括：
2.根据权利要求1所述的cd3特异性抗体，还包括：
3.根据权利要求1或2所述的cd3特异性抗体，其中所述cd3特异性抗体为纳米抗体。
4.根据权利要求1或2所述的cd3特异性抗体，其中所述cd3特异性抗体为还包括恒定区ch2和ch3以及铰链区的重链抗体；优选地，所述重链抗体为人源化的嵌合抗体，包括人源igg1的恒定区ch2和ch3以及铰链区。
5.一种核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的cd3特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括：
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中所述核酸分子还包括：
8.一种表达载体，包含权利要求5-7中任一项所述的核酸分子；优选地，所述表达载体是质粒，如pmecs系列质粒、pcdna质粒如pcdna3.1质粒。
9.一种表达细胞，包含权利要求5-7中任一项所述的核酸分子或者权利要求8所述的表达载体；优选地，所述表达细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞，如wk6、bl21...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨娇明，王媚娘，刘小盼，邓国渊，谢彩霞，罗小斐，卢烁，刘淡珊，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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