本发明专利技术提供一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒至少包含：包被有链霉亲和素的孔板、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液、读数液、新冠病毒S蛋白标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品。本发明专利技术以生物素标记的抗新冠棘突蛋白的抗体1与链霉亲和素板进行连接作为固定相，以新冠S蛋白、RBD蛋白作为参照品，可被SULFO标记的抗体2识别，从而检测新冠抗原的表达情况。该试剂盒能准确灵敏地定量检测不同基质中的新冠S蛋白、RBD蛋白，样品的前处理过程简单，耗时少，可同时检测大量样品。本发明专利技术对于大批量样品的新冠病毒疫苗表达抗原的检测具有重要意义。表达抗原的检测具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及免疫检测领域，具体地说，涉及一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒。
技术介绍
[0002]2019年至今，新冠疫情给全球经济，生活以及健康造成了巨大损失，新冠疫苗作为预防控制传染病最经济有效的手段，是控制新冠疫情的关键所在。新冠病毒疫苗 研发正在以前所未有的速度进行，根据WHO统计，截至12月2日，全球有超过214种候选疫苗正在研发，其中51种已经进入临床试验阶段, 13种疫苗进入Ⅲ期临床。其中主要的疫苗类型包括：病毒灭活疫苗、基因工程重组疫苗、病毒载体类疫苗、核酸类疫苗（质粒DNA、mRNA等）等多条技术路线齐头并进。从临床3期试验结果来看，取得了较好的临床效果。12月2日，英国政府宣布，该国药品和保健品管理局（MHRA）批准使用辉瑞公司和德国生物新技术公司研发的新冠疫苗，将从下周开始在全英推出，这一紧急授权为英国的疫苗部署扫清了道路。但其安全性、免疫原性、有效性等问题仍然备受关注。
[0003]对于不同类型的新冠疫苗而言，理想状态是应具有良好的免疫原性，到达体内后，能激发机体广泛的免疫应答（体液免疫与细胞免疫）；能刺激B细胞产生强抗原，减少非中和或者弱抗原的产生；并对人体有持久的保护作用。
[0004]疫苗研发是一个科学，严谨，复杂的过程，往往需要5-10年的过程，但由于新冠疫情大规模爆发，需在更短的时间内有效控制新冠疫情的蔓延，这就要求对疫苗研发的全过程进行严格的质量控制。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中棘突蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基，S1亚基与S2亚基。其中S1主要包含有受体结合区（receptorbinding domain，RBD），负责识别细胞的受体。SARS-CoV-2 (2019-nCoV)的棘突蛋白与人血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）蛋白互作来感染人的呼吸道上皮细胞。棘突蛋白承担新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是新冠疫苗设计的关键靶点。棘突蛋白作为重要的免疫原蛋白关系到该疫苗是否能够刺激机体产生有效的保护性抗体。
[0005]现有检测新型冠状病毒疫苗的棘突蛋白的方法为酶联免疫法，由于实验周期长，不可控性因素多，检测重复性差；此外样本用量较多；大部分种类的疫苗抗原成分复杂，棘突蛋白含量较少，需要更加灵敏的方法进行检测与疫苗质量控制。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是提供一种具有操作简单，高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的电化学发光免疫检测试剂盒，用于新型冠状病毒及疫苗制品中棘突蛋白的快速检测。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒至少包含：包被有链霉亲和素的孔板（如96孔板）、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液和读数
液，以及新冠病毒S蛋白（S三聚体蛋白）标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品。
[0008]其中，所述抗新冠棘突蛋白抗体1的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；所述抗新冠棘突蛋白抗体2的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示。抗体1、抗体2是从通过免疫小鼠新冠棘突蛋白进行亲和力测试与配对筛选并获取可变区序列并重组得到的。用新冠棘突蛋白免疫小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，从众多克隆中选择亲和力高，能够联合用于（抗体表位分析）检测新冠棘突蛋白的抗体对，然后分别进行生物素标记与SULFO标记。选择配对抗体的方法为生物膜干涉技术。抗体1、抗体2分别结合新型冠状病毒S蛋白或RBD蛋白的不同抗原表位。
[0009]所述读数液是一种基于Tris的缓冲液，其中含有三丙胺（TPA）作为共轭反应物，可在电化学发光免疫分析中产生光。
[0010]进一步地，孔板上包被的链霉亲和素的浓度为2ug/ml。
[0011]孔板包被链霉亲和素之后，需进行封闭处理。例如，在96孔链霉亲和素板中加入150μL MSD封闭液，在室温下，封闭1h后，将液体甩干，并晾干密封。所用封闭液是含2%酪蛋白的PBS溶液。
[0012]所述洗涤液为含有0.5%v/v Tween-20的PBS溶液，pH7.4。
[0013]本专利技术中，PBS溶液的配制如下：将0.2722g KH2PO4，3.58g Na2HPO4.12H2O，8.0063g NaCl和0.2066g KCl溶于1L水中。
[0014]本专利技术中，上述洗涤液亦可作为样品稀释液。使用时，需要用水进行20倍稀释变成工作液。
[0015]进一步地，所述读数液为含有0.5 %v/v三丙胺的Tris溶液。
[0016]本专利技术中，Tris溶液的配制如下：将2.4228g Tris和8.766g NaCl溶于1L水中。
[0017]进一步地，所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1中生物素与抗新冠棘突蛋白抗体1的摩尔比为为2:1，且生物素标记到抗新冠棘突蛋白抗体1的赖氨酸上。
[0018]进一步地，所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2中SULFO与抗新冠棘突蛋白抗体2的摩尔比为2:1，且SULFO标记到抗新冠棘突蛋白抗体1的赖氨酸上。
[0019]本专利技术的试剂盒中，所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、上述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、所述新冠病毒S蛋白标准品、所述新冠病毒RBD蛋白标准品可以是冻干粉形式。
[0020]本专利技术的新冠S蛋白、新冠RBD蛋白均为人细胞HEK293细胞表达，新冠S蛋白维持其天然三聚体的蛋白结构。该蛋白结构经过MALS与负染电镜进行了结构验证。新冠S蛋白、RBD蛋白在GenBank上的参考序列编号为QHD43416.1。
[0021]本专利技术试剂盒的检测原理：基于双抗体夹心法检测蛋白，96孔链霉亲和素板上的各实验孔与阳性对照孔均加入预混1h的生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1和SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2以及梯度稀释的新冠S三聚体蛋白或新冠RBD蛋白。然后在化学发光仪上加入读数液进行读数。当待测的新冠棘突蛋白浓度越高时，则被结合到生物素抗新冠棘突蛋白抗体1的蛋白量越高，同时被SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2检测到的信号越高。根据用已知的新冠棘突蛋白的浓度所绘制的标准曲线，可以推算出待测样本中新冠棘突蛋白的含量。
[0022]第二方面，本专利技术提供所述试剂盒在新冠病毒疫苗抗原蛋白的电化学发光免疫检
测及新冠疫苗质控中的应用。
[0023]第三方面，本专利技术提供新冠病毒疫苗抗原蛋白（S蛋白）的电化学发光免疫检测方法，包括：1）配制不同浓度的新冠病毒S蛋白标准品溶液，浓度范围为3.052pg/mL~6250pg/mL；例如，配制浓度为6250pg/mL，3125pg/mL，1562.5pg/mL，781.25pg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包含：包被有链霉亲和素的孔板、生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、洗涤液和读数液，以及新冠病毒S蛋白标准品和新冠病毒RBD蛋白标准品；其中，所述抗新冠棘突蛋白抗体1的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；所述抗新冠棘突蛋白抗体2的重链、轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和4所示；所述读数液中含有三丙胺。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，孔板上包被的链霉亲和素的浓度为2ug/ml。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含有0.5%v/v Tween-20的PBS溶液，pH7.4。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述读数液为含有0.5 %v/v三丙胺的Tris溶液。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1中生物素与抗新冠棘突蛋白抗体1的摩尔比为2:1。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2中SULFO与抗新冠棘突蛋白抗体2的摩尔比为2:1。7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗新冠棘突蛋白抗体1、所述SULFO标记的抗新冠棘突蛋白抗体2、所述新冠病毒S蛋白标准品、所述新冠病毒RBD蛋白标准品为冻干粉形式；所述包被有链霉亲和素的孔板为96孔板。8.权利要求1-7任一项所述试剂盒在新冠病毒疫苗表达抗原蛋白的电化学发光免疫检测中的应用。9.新冠病毒疫苗抗原蛋白的电化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括：1）配制不同浓度的新冠病毒S蛋白标准品溶液，浓度范围为3.052pg/mL~6250pg/mL；2）将上述新冠病毒S蛋白标准品溶液分别加入到包被有链霉亲和素的孔板中，25-30μL/孔，然...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛平菊，苗景赟，王恒玲，张兴琳，焦秋玲，
申请(专利权)人：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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