一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，采用免疫荧光染色和非免疫荧光标记两种染色方法分别对细胞团的细胞膜和细胞核进行荧光染色，来观察非石蜡切片法在荧光标记细胞团的细胞中的适用情况，具体步骤如下：1)全细胞准备；2)将步骤1)中的全细胞进行细胞团培养；3)对步骤2)中的细胞团进行非免疫荧光标记；4)对步骤2)中的细胞团进行免疫荧光标记；5)对步骤3)和步骤4)中的荧光标记后的细胞团进行激光共聚焦显微观察，实验步骤简单、结果快速、用时短、使用样本量少、实验过程避免用到有害的挥发性试剂等，且真实反映了膜蛋白的原始性质，得到的结果更加真实、清楚。清楚。清楚。

【技术实现步骤摘要】
一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法。

技术介绍

[0002]细胞的聚团培养首先被Reynold和Weiss用于分离干细胞。之后，细胞聚团培养方法被应用于许多细胞的研究，比如神经干细胞、角膜干细胞、肿瘤干细胞等等。我们经常会对培养的细胞进行荧光染色分析。对贴壁培养的细胞进行定性荧光分析时，由于细胞单层贴壁，我们则可以不经过石蜡包埋而直接对细胞固定染色。但对细胞团进行荧光染色来做定性的分析时，我们通常会对细胞团进行石蜡包埋切片。这种石蜡切片技术要经过固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡等一系列复杂而耗时的程序，并且这种剧烈的处理方法还会对细胞中的抗原有着一定程度的损害。
[0003]人输卵管内膜干细胞可以在三维凝胶培养系统中形成细胞团块，并且输卵管内膜干细胞都是呈上皮特异性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)阳性。EpCAM是一种跨膜蛋白，广泛分布于上皮细胞及快速增殖的肿瘤细胞上，我们利用小鼠抗EpCAM的一抗对输卵管内膜干细胞团细胞进行标记，然后用Dylight-488的偶联山羊抗小鼠的IgG来结合一抗，来探讨细胞团的EpCAM的检出情况。
[0004]EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，可快速准确的检测细胞的增殖能力。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而且EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更快速便捷地反映DNA复制活性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，采用免疫荧光染色和非免疫荧光标记两种染色方法分别对细胞团的细胞膜和细胞核进行荧光染色，来观察非石蜡切片法在荧光标记细胞团的细胞中的适用情况，具体步骤如下：
[0008]1)全细胞准备；
[0009]2)将步骤1)中的全细胞进行细胞团培养；
[0010]3)对步骤2)中的细胞团进行非免疫荧光标记；
[0011]4)对步骤2)中的细胞团进行免疫荧光标记；
[0012]5)对步骤3)和步骤4)中的荧光标记后的细胞团进行激光共聚焦显微观察。
[0013]进一步，步骤1)中所述全细胞准备的具体步骤为：取6-8周龄ICR雌鼠，断颈处死后
取输卵管，去掉周围的脂肪组织及系膜，用眼科镊子撕碎，放入含有0.25mg/ml的胶原蛋白酶I和II的PBST中，37℃消化20分钟，然后轻轻吹打使细胞分散，300g离心5min后加入5ml含10％FBS的PrEGM培养基悬浮细胞，然后通过直径为40μm的细胞过滤器过滤掉没有消化的组织团块，得到细胞悬浮液，300g离心5min，再用含10％FBS的PrEGM培养液稀释至细胞浓度为1
×
107/ml，得到细胞溶液备用。
[0014]进一步，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行细胞团培养的具体步骤为：
[0015]取0.1ml细胞溶液与0.9ml水凝胶溶液混合，反复轻轻吹打混匀，得到细胞-水凝胶混合溶液；
[0016]取0.15-0.25ml的细胞-水凝胶混合溶液放入12孔板中，37℃培养箱中静止5min使凝胶凝固，然后加入1ml含10％FBS的PrEGM培养基在5％CO2，37℃培养箱中培养6天，将培养6天后的细胞-水凝胶混合溶液，放置到冰上静止5min，使凝胶溶解，将凝胶溶液收集到15ml的离心管中，300g离心3min，用冷PBS洗2次，每次300g，3分钟，收集细胞团Ⅰ备用。
[0017]进一步，步骤3)中所述对步骤2)中的细胞团进行非免疫荧光标记的具体步骤为：
[0018]取细胞团Ⅰ，用含5-80μM EdU的PrEGM培养基培养细胞团Ⅰ6h，使EdU插入到细胞团Ⅰ细胞中复制的DNA中，然后用-20℃甲醇将入EdU的细胞团Ⅰ固定插4h以上，将固定后的细胞团Ⅰ，300g离心3min，用含0.1-0.4％TritonX-100的PBST洗5-10min，得到细胞团Ⅱ；
[0019]将细胞团Ⅱ放入1ml的1
×
Apollo染色反应液，避光、室温、摇床孵育60min，然后用Hoechst33342染细胞核，300g离心3min，收集细胞团Ⅲ避光保存，备用。
[0020]进一步，所述EdU的浓度为50μM，所述TritonX-100的浓度为0.2％，所述细胞-水凝胶混合溶液的用量为0.2ml。
[0021]进一步，步骤3)中所述对步骤2)中的细胞团进行免疫荧光标记的具体步骤为：
[0022]取细胞团Ⅰ，用甲醇在-20℃条件下固定4小时以上，300g离心3min，离心后的细胞团Ⅰ用含0.1-0.4％Triton X-100的PBST洗5min，得到细胞团Ⅳ；
[0023]将细胞团Ⅳ放入含10-40％山羊血清的PBST中封闭孵育3h，离心，将离心后的细胞团Ⅳ放入含1:100-400mouse anti-EpCAM一抗的PBST溶液，4℃冰箱内过夜孵育，用含1％山羊血清的PBST清洗2次，每次5分钟，再300g离心5分钟，收集离心后的沉淀细胞团
Ⅴ
；
[0024]将细胞团
Ⅴ
用含1:200-1000山羊抗小鼠IgG(Dylight-488)二抗的PBST室温培养2h后，用PI复染细胞核，得到细胞团
Ⅵ
，收集细胞团
Ⅵ
避光保存，备用。
[0025]进一步，所述Triton X-100的浓度为0.2％，所述山羊血清的浓度为20％，所述mouseanti-EpCAM一抗的浓度比例为1：200，所述山羊抗小鼠IgG(Dylight-488)二抗的浓度比例为1：400。
[0026]进一步，所述一抗为任意的一抗，所述二抗为与一抗相匹配的荧光偶联二抗。
[0027]进一步，步骤3)中所述对步骤3)和步骤4)中的荧光标记后的细胞团进行激光共聚焦显微观察的具体步骤为：分别取50μl的细胞团Ⅲ和细胞团
Ⅵ
的悬浮液放入玻璃底培养皿中，置于共聚焦载物台上静止1-2min，用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。
[0028]由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：
[0029]1.本专利技术采用了免疫荧光染色和非免疫荧光标记两种染色方法分别对小鼠输卵管内膜干细胞的细胞膜和细胞核进行荧光染色，探讨非石蜡切片法在荧光标记细胞团的细胞中的适用情况，专利技术了一种细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，其特征在于，采用免疫荧光染色和非免疫荧光标记两种染色方法分别对细胞团的细胞膜和细胞核进行荧光染色，来观察非石蜡切片法在荧光标记细胞团的细胞中的适用情况，具体步骤如下：1)全细胞准备；2)将步骤1)中的全细胞进行细胞团培养；3)对步骤2)中的细胞团进行非免疫荧光标记；4)对步骤2)中的细胞团进行免疫荧光标记；5)对步骤3)和步骤4)中的荧光标记后的细胞团进行激光共聚焦显微观察。2.如权利要求1所述的一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，其特征在于，步骤1)中所述全细胞准备的具体步骤为：取6-8周龄ICR雌鼠，断颈处死后取输卵管，去掉周围的脂肪组织及系膜，用眼科镊子撕碎，放入含有0.25mg/ml的胶原蛋白酶I和II的PBST中，37℃消化20分钟，然后轻轻吹打使细胞分散，300g离心5min后加入5ml含10％FBS的PrEGM培养基悬浮细胞，然后通过直径为40μm的细胞过滤器过滤掉没有消化的组织团块，得到细胞悬浮液，300g离心5min，再用含10％FBS的PrEGM培养液稀释至细胞浓度为1
×
107/ml，得到细胞溶液备用。3.如权利要求2所述的一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，其特征在于，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行细胞团培养的具体步骤为：取0.1ml细胞溶液与0.9ml水凝胶溶液混合，反复轻轻吹打混匀，得到细胞-水凝胶混合溶液；取0.15-0.25ml的细胞-水凝胶混合溶液放入12孔板中，37℃培养箱中静止5min使凝胶凝固，然后加入1ml含10％FBS的PrEGM培养基在5％CO2，37℃培养箱中培养6天，将培养6天后的细胞-水凝胶混合溶液，放置到冰上静止5min，使凝胶溶解，将凝胶溶液收集到15ml的离心管中，300g离心3min，用冷PBS洗2次，每次300g，3分钟，收集细胞团Ⅰ备用。4.如权利要求3所述的一种非石蜡切片法荧光标记细胞团细胞的方法，其特征在于，步骤3)中所述对步骤2)中的细胞团进行非免疫荧光标记的具体步骤为：取细胞团Ⅰ，用含5-80μM EdU的PrEGM培养基培养细胞团Ⅰ6h，使EdU插入到细胞团Ⅰ细胞中复制的DNA中，然后用-20℃甲醇将入EdU的细胞团Ⅰ固定插4h以上，将固定后的细胞团Ⅰ，300g离心3min，用含0.1-0.4％TritonX-100的PBST洗5-10min，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨信志，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：