基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法及应用技术

本发明专利技术建立针对PPRV H蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法，设计合成PPRV H蛋白B细胞表位作为抗原，通过优化各步反应条件，确定临界值且进行特异性、敏感性及重复性试验。研究证实建立的检测方法临界值为S/P>9.77％，敏感性为95.43％，特异性为92.23％，批内及批间变异系数均小于10％，具有良好的敏感性、特异性和可重复性。通过对247份田间血清的平行检测，建立的方法与国外商品化PPRV cELISA试剂盒相对符合率为94.33％，且该方法敏感性高于国外商品化PPRV cELISA试剂盒。表明建立的H蛋白抗体化学发光免疫分析方法可用于相关检测试剂盒的开发。试剂盒的开发。试剂盒的开发。

【技术实现步骤摘要】
基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法及应用。

技术介绍

[0002]小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)属于副黏病毒科麻疹病毒属，是由小反刍兽疫病毒(PPR virus,PPRV)引起的一种急性、热性传染病，具有高度的传染性和致死性。该病毒有一个血清型4个谱系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)(V.Balamurugan,Hemadri,Gajendragad,&Singh
…
,2014；V.S.Balamurugan,A.；Venkatesan,G.；Yadav,V.；Bhanot,V.；Riyesh,T.；Bhanuprakash,V.；Singh,R.K,2010)，我国流行的主要为IV系。PPRV为单股负链RNA病毒，其基因组共编码8个蛋白，3
′
端到5
′
端编码的结构蛋白分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝集素蛋白(H)和大蛋白(L)，2个非结构蛋白(C、V)则由P基因编码产生(Bailey,Banyard,Ozkul,&Barrett,2005)。PPRV主要感染山羊和绵羊等小反刍类动物(Gibbs,Taylor,Lawman,&Bryant,1979)，但近年来，PPRV感染宿主呈现多样化，据报道骆驼(Albayrak&G
ü
r,2010；Intisar et al.,2017)、牛和水牛等大型反刍动物也可被感染(V.Balamurugan et al.,2014；Maillard et al.,2008；Zakian,Nouri,Kahroba,Mohammadian,&Mokhber-Dezfouli,2016)，但通常为亚临床感染。此外，狮子和犬(Ratta et al.,2016)、瞪羚羊、大羚羊、蓝羚羊(Furley,Taylor,&Obi,1987)以及野猪(Schulz,Fast,Schlottau,Hoffmann,&Beer,2018)也可感染PPRV。PPRV为高度接触性传染病，主要通过直接接触经呼吸系统传播，也可通过精液、胚胎和乳汁等途径传播。PPRV感染后临床症状主要表现为发热、肺炎、腹泻，呼吸道和消化道黏膜炎症等。鉴于其在全球的流行情况，PPR被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病(Santhamani,Singh,&Njeumi,2016)，我国也将其列为一类动物传染病。
[0003]PPR自2007年传入我国以来，在我国西藏、山东、内蒙古等多个省份蔓延传播，对我国畜牧业的健康、有序发展造成严重挑战(Liu et al.,2018)，因此快速准确地对其进行检测显得尤为重要。目前采用的针对PPRV病原或者抗体检测方法主要有中和试验、病毒的分离鉴定、qRT-PCR试验以及基于N蛋白和H蛋白抗体的ELISA方法等。由于N蛋白和H蛋白抗原性较稳定，产生的抗体在PPRV感染后的血清抗体中占主导地位，因此N、H蛋白成为了PPR诊断试剂研发的主要靶蛋白(孙雨，宋晓晖，王传彬，等,2017)。但N蛋白的表达通常以不溶性的包涵体形式存在，鲜有报道其为可溶性表达(Taylor,2016)，要获得高浓度和高纯度的N蛋白具有一定的难度，不利于检测技术的进一步商业开发。此外，麻疹病毒属病毒中N蛋白高度保守，不能诱导机体产生针对病毒的免疫保护，以N蛋白为基础建立的检测方法会产生一定的交叉反应。H蛋白在麻疹病毒属所有成员中不仅最为多样化，而且种属特异性强，可诱导机体产生保护性免疫反应，因此该蛋白在DIVA(区分疫苗免疫和自然感染动物)和免疫保护率检测上具有相当的优势。宿主的体液免疫反应也主要针对H蛋白，该蛋白也是麻疹病
毒属最为重要的抗原决定蛋白(Vongpunsawad,Oezgun,Braun,&Cattaneo,2004；Yoneda et al.,2002)。
[0004]化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)技术由免疫反应和化学发光反应两部分相结合，对抗原或抗体进行检测的免疫分析技术，因该技术具有灵敏度高、分析方法简便快捷、操作方便等优点而被广泛用于检测技术的开发，但目前基于化学发光的PPR检测技术尚未见报道。本研究基于本实验室对PPRVH蛋白B细胞表位预测及反应原性和免疫效力评价的基础之上，挑选在不同毒株之间都保守且反应原性较好的B细胞表位片段以柔性氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)作为连接位点串联，进行多肽合成，以此作为包被抗原，通过优化各步反应条件建立针对PPRVH蛋白抗体的化学发光免疫分析检测方法，有效弥补化学发光免疫分析技术在PPR检测方法上的缺失。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法，包括以下步骤：
[0006](1)H蛋白B细胞抗原表位的筛选、多肽的设计合成
[0007](2)H蛋白抗体化学发光检测方法的建立
[0008]将合成的表位肽用pH值为9.6的碳酸氢盐缓冲液稀释后包被96孔化学发光酶标板，放于4℃过夜孵育；取出酶标板用PBST缓冲液洗板3次后甩干；每孔加入200μL 2％BSA-PBST溶液于37℃封闭1h，洗板3次后甩干；加入经稀释后的血清，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3次后甩干；加入经稀释后的酶标二抗，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3-5次后甩干。底物A液和B液按照1:1进行混合，每孔100μL加入酶标孔，于常温黑暗处反应5min，之后在化学免疫分析仪器上测定发光值；
[0009]对检测的血清样品用阳性率(S/P)进行表示，即S/P＝(待测样品发光值/标准阳性样品平均发光值)
×
100％；S/P值大于临界值即检测为阳性，；S/P值小于等于临界值即为阴性。
[0010]优选地，所述步骤(1)具体为：利用IEDB、Immunomedicine Group以及BepiPred三种生物信息学软件对H蛋白的B细胞抗原表位进行预测，共得到27条抗原表位肽并合成这些多肽，然后利用iELISA方法对其与PPRV阳性血清的反应原性进行鉴定，选取其中反应原性最好的4个B细胞表位H123、H185、H362、H487以GS作为接头串联，合成该肽段。
[0011]优选地，包被抗原浓度为1.5
×
10-6μg/孔；
[0012]血清稀释度为1:100；
[0013]血清反应时间为10min；
[0014]酶标二抗反应时间为10min；
[0015]检测的临界值为S/P＝9.77％。
[0016]基于H蛋白表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体化学发光检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)H蛋白B细胞抗原表位的筛选、多肽的设计(2)H蛋白抗体化学发光检测方法的建立将合成的表位肽用pH值为9.6的碳酸氢盐缓冲液稀释后包被96孔化学发光酶标板，放于4℃过夜孵育；取出酶标板用PBST缓冲液洗板3次后甩干；每孔加入200μL 2％BSA-PBST溶液于37℃封闭1h，洗板3次后甩干；加入经稀释后的血清，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3次后甩干；加入经稀释后的酶标二抗，置于37℃温箱中孵育10min；洗板3-5次后甩干；底物A液和B液按照1:1进行混合，每孔100μL加入酶标孔，于常温黑暗处反应5min，之后在化学免疫分析仪器上测定发光值；对检测的血清样品用阳性率(S/P)进行表示，即S/P＝(待测样品发光值/标准阳性样品平均发光值)
×
100％；S/P值大于临界值即检测为阳性，S/P值小于等于临界值即为阴性。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱榜，窦永喜，朱学亮，蒙学莲，张学燕，赵帅阳，孙跃峰，张志东，李彦敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：