基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于双抗体夹心均相化学发光技术的猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、阳性对照和阴性对照，本发明专利技术所述试剂R1中的供体微球能够在680nm光的激发下产生单体氧；所述试剂R2中的受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm化学发光信号。因此在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现猪瘟病毒的检测。另外，本发明专利技术的试剂盒10min内即可完成抗体检测，且本发明专利技术的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。重复性都很好。重复性都很好。

【技术实现步骤摘要】
基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物诊断试剂
，尤其涉及基于一种基于双抗体夹心化学发发光法猪瘟病毒检测试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classical swine fever,CSF或Hog cholera,HC)，又称经典猪瘟或古典猪瘟，是猪的一种高传染性疾病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，并可能伴有神经症状。母猪可能会流产或产下死猪崽。猪瘟为世界动物卫生组织所列的A类中16种法定传染病之一。古典猪瘟病毒(Classical swinefevervirus,CSFV)为黄病毒科瘟疫病毒属。同属的病毒还有感染反刍动物的牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhoeavirus,BVDV)及羊的边界病病毒(BorderDisease virus,BDV)。猪是古典猪瘟病毒的唯一宿主和传播源。受到感染的猪在发病前和发病期间都会排毒。
[0003]CSFV为有囊膜病毒，40-60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，ORF两侧是5
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端非翻译区(5
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UTR)和3
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端非翻译区(3
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UTR)，且5/>’-
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端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下，加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、 P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。
[0004]E2为CSFV的囊膜糖蛋白，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低.最易变异的分子。E2常以100kDa的同源二聚体及与E1形成 75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外E2 可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。E2的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690-1060氨基酸残基)组成.并以其c端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可为 51-58kDa。E2分子内的15个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，c端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。因此，猪瘟E2蛋白可作为防治和检测猪瘟的一种靶蛋白。
[0005]国内外许多实验室已经研发出许多猪瘟病毒的检测方法，例如酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法等等。荧光PCR检测方法耗时耗力；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择，但磁微粒化学发光成本较高，且对仪器设备的要求就高，因此均相化学发光技术是一个合适的选择。该技术与荧光PCR检测方法相比，操作简单，反应时间短，该方法敏感性与精确度好，检测范围广。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决当前市场上猪瘟病毒诊断试剂存在的成本高、耗时长、精度低等问题，从而提出的一种双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒。
[0007]因此，本专利技术一方面提供了一种双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、阳性对照和阴性对照，其中：所述试剂R1包括标记链霉亲和素的供体微球的缓冲液，所述供体微球能够在680nm光下激发产生单体氧；所述试剂R2包括标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球的缓冲液，所述受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm 化学发光信号；所述试剂R3为生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体的缓冲液。
[0008]优选地，本专利技术所述的试剂R2中标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球为标记抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的受体微球，所述的缓冲液为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH 为7.2。
[0009]优选地，本专利技术所述的试剂R3中生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体为生物素化的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，所述生物素化的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体的浓度为0.5μg/mL，所述的缓冲液为0.01M PBS缓冲液、2％ BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH为7.2。
[0010]优选地，本专利技术所述的阳性对照为灭活的猪瘟病毒荧光PCR CT值在25
±
1 之间的猪血清；所述阴性对照为灭活的猪瘟病毒荧光PCR无CT值的猪血清。
[0011]优选地，本专利技术所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。
[0012]优选地，本专利技术所述的试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL；所述的试剂 R2中受体微球的浓度为2μg/mL。
[0013]优选地，本专利技术所述试剂R1的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、 0.1％Proclin 300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。
[0014]另一方面，本专利技术还还提供了一种制备所述试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：
[0015]1)试剂R1制备：
[0016]a)供体微球准备：量取10mg 150nm的供体微球和1mg链霉亲和素，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至 10mg/mL；b)反应：加入100μLpH值为6.0的0.05M MES配制的50mg/mL 的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃ 12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mLpH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为5μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
[0017]2)试剂R2制备：
[0018]a)受体微球准备：量取10mg 150nm的受体微球和2mg的抗猪瘟病毒E2 蛋白单克隆抗体，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节受体微球浓度至10mg/mL；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双抗体夹心均相化学发光法猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、阳性对照和阴性对照，其中：所述试剂R1包括标记链霉亲和素的供体微球的缓冲液，所述供体微球能够在680nm光下激发产生单体氧；所述试剂R2包括标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球的缓冲液，所述受体微球能够与单体氧反应生成可检测的615nm化学发光信号；所述试剂R3为生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体的缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中标记抗猪瘟病毒单克隆抗体的受体微球为标记抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的受体微球，所述缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R3中生物素化的抗猪瘟病毒单克隆抗体为生物素化的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，所述生物素化的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体的浓度为0.5μg/mL，所述缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH值为7.2。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为灭活的猪瘟病毒荧光PCR CT值在25
±
1之间的猪血清；所述阴性对照为灭活的猪瘟病毒荧光PCR无CT值的猪血清。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL；所述的试剂R2中受体微球的浓度为2μg/mL。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述试剂R1的缓冲液组分为0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、0.1％Tween-20，其余为纯化水，pH 7.2。8.一种制备如权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：8-1)试剂R1制备：a)供体微球准备：量取10mg 150nm的供体微球和1mg链霉亲和素，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH值为6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mLpH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用0.01M PBS缓冲液、2％BSA、0.1％Proclin 300、0.1％T...

【专利技术属性】
技术研发人员：查银河，陈勇锋，舒建洪，杨芳，黄磊，童夏霞，陈聪，周泉丽，林渝钧，赵海波，
申请(专利权)人：浙江理工大学浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：