一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和阳性对照、阴性对照。本发明专利技术还公开了一种该试剂盒的制备方法。本发明专利技术所述供体微球能够在激发状态产生活性氧，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号，因此在检测时不需要清洗和分离，可以直接检测化学发光信号，从而实现猪圆环病毒2型抗体的检测。另外，本发明专利技术的试剂盒10min内即可完成抗体检测，且本发明专利技术的试剂盒的特异性、敏感性、重复性都很好。重复性都很好。重复性都很好。

【技术实现步骤摘要】
一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物诊断试剂
，尤其涉及竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒病是一种近年来倍受关注的广泛流行于世界各地的疾病,它是由猪圆环病毒型引起的一系列疾病的总称。1974年等首次发现猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)。属圆环病毒科、圆环病毒属,是已知的最小的动物病毒之一。猪圆环2型(PCV2)具有极高的致病性病毒具有猪圆环二型病毒主要感染猪，目前该病已在我国猪群中广泛流行,给养猪业造成巨大的经济损失,严重危害养猪业发展,需引起高度重视。
[0003]PCV2的基因组非常小，基因组全长为PCV2为1767-1768bp，PCV2含有11个ORFs,分别编码1.8-35.8kD的蛋白质，ORF1和ORF2是PCV2的两个主要开放性阅读框，反向编码两种蛋白ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep)，ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)，后者包含具有免疫原性的抗原表，因此能够用于PCV2病毒的检测。ORF2是PCV基因组中的第二大阅读框，编码Cap蛋白(又称核衣壳蛋白)，为病毒的主要结构蛋白，包含病毒主要的抗原表位，由233个氨基酸组成，分子量约为30KD。利用单克隆抗体和猪阳性血清检测分析，ORF2基因含有多个抗原结合位点：69-83aa，117-131aa，132-146aa，156-162aa，169-183aa，175-192aa，195-202aa和230-233aa。
[0004]国内外许多实验室已经研发出许多猪圆环病毒2型抗体的检测方法，例如酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法等等。ELISA检测方法耗时耗力；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择，但磁微粒化学发光成本较高，且对仪器设备的要求就高，因此均相化学发光技术是一个合适的选择。该技术与ELISA检测方法相比，操作简单，反应时间短，该方法敏感性与精确度好，检测范围很广。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有PCV2抗体检测方法存在费时费力等问题，从而提出的一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。
[0006]因此，本专利技术一方面提供了一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2以及阳性对照和阴性对照，其中：所述试剂R1包括供体微球以及与之结合的猪圆环病毒2型Cap蛋白的缓冲液，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；所述试剂R2包括受体微球以及与之结合的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的缓冲液，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号。
[0007]优选地，本专利技术所述阳性对照为猪圆环病毒2型IFA抗体效价为1:64的猪血清；所述阴性对照为猪圆环病毒2型IFA抗体效价为1:4的猪血清。
[0008]优选地，本专利技术所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。
[0009]优选地，本专利技术所述的试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL。
[0010]优选地，本专利技术所述的试剂R2中受体微球的浓度为2μg/mL。
[0011]优选地，本专利技术所述试剂R1的缓冲液组分为120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH 7.4。
[0012]优选地，本专利技术所述试剂R2的缓冲液组分为100mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH为7.6。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了一种制备所述的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014]1)试剂R1制备：
[0015]a)供体微球准备：量取10mg150nm的供体微球和2mg猪圆环病毒2型Cap蛋白，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH值为6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH 7.4的缓冲液溶解清洗好的供体微球，使其终浓度为5μg/mL，超声分散后置于4℃保存备用；
[0016]2)试剂R2制备：
[0017]a)受体微球准备：量取10mg150nm的受体微球和2mg的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体，迅速混匀，再加入pH值为6.0的0.05M MES缓冲液调节受体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL的pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为50mg/mL的NaBH3CN溶液，混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH值为6.0的0.05M MES配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液进行封闭，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL pH值为6.0的0.05M MES缓冲液超声悬浮，再次离心，弃去上清，最后用100mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH为7.6的缓冲液溶解上述步骤中制备的受体微球，使其终浓度为2μg/ml，超声分散后置于4℃保存备用。
[0018]再一方面，本专利技术还提供了一种使用所述的试剂盒检测猪圆环病毒2型抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0019]1)将阳性血清、阴性血清或者含有猪圆环病毒2型抗体样本与试剂盒中的试剂R1和试剂R2按照体积比为10μL:50μL:50μL的量混合，混合液置于37℃下温育5min；
[0020]2)在温育后，立即通过光电倍增管检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，记录阳性对照、阴性对照和样本的化学发光值；
[0021]3)根据化学发光值，计算阻断率，其中阻断率＝1-样品化学发光值/阴性对照化学发光值；当阻断率≥35％时，判为猪圆环病毒2型抗体阳性；当阻断率＜35％时，判为猪圆环病毒2型抗体阴性。
[0022]再一方面，本专利技术还提供了一种所述的试剂盒在检测猪圆环病毒2型抗体中的应用。
[0023]有益效果：本专利技术所述供体微球能够在激发状态产生活性氧，所述受体微球能够与活性氧反应生成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种竞争均相化学发光法猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2以及阳性对照和阴性对照，其中：所述试剂R1包括供体微球以及与之结合的猪圆环病毒2型Cap蛋白的缓冲液，所述供体微球能够在激发状态产生活性氧；所述试剂R2包括受体微球以及与之结合的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的缓冲液，所述受体微球能够与活性氧反应生成可检测的化学发光信号。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪圆环病毒2型IFA抗体效价为1:64的猪血清；所述阴性对照为猪圆环病毒2型IFA抗体效价为1:4的猪血清。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的供体微球和受体微球的直径均为150nm。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1中供体微球的浓度为5μg/mL；所述的试剂R2中受体微球的浓度为2μg/mL。5.根据权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的缓冲液组分为120mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH 7.4。6.根据权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的缓冲液组分为100mM Hepes缓冲液、0.1％Proclin 300、5％蔗糖、5％NaCl、0.1％曲拉通，其余为纯化水，pH为7.6。7.一种制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：7-1)试剂R1制备：a)供体微球准备：量取10mg 150nm的供体微球和2mg猪圆环病毒2型Cap蛋白，迅速混匀，再加入pH 6.0的0.05M MES缓冲液调节供体微球浓度至10mg/mL；b)反应：加入100μL pH 6.0的0.05M MES配制的50mg/mL的NaBH3CN溶液，迅速混匀，室温旋转反应12～16h；c)封闭：加入pH 6.0的0.05M MES缓冲液配制的浓度为100mg/mL的BSA溶液，其与反应液体积比为1:4，迅速混匀，室温旋转反应3小时；d)清洗：反应好的溶液4℃12000rpm离心60min，弃去上清，加入2mL p...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒建洪，陶思锐，查银河，杨芳，黄磊，童夏霞，
申请(专利权)人：浙江理工大学浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：