VSV制造技术

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种

【技术实现步骤摘要】
VSV
△
G复制缺陷型病毒制备及应用


[0001]本申请涉及免疫
，具体涉及一种
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒的获取方法及其在假病毒制备中的应用
。

技术介绍

[0002]复制缺陷型假病毒，近年被用于评价中和抗体水平，加速了传染病疫苗
、
药物等的研发
。VSV
病毒因其不依赖包膜蛋白特性的特征，可用于包装多种病毒包膜蛋白的假病毒
。VSV
△
G
病毒，即
G
蛋白编码基因缺陷的
VSV
病毒，具有复制缺陷性，可用于包装多种复制缺陷型假病毒
。VSV
△
G
种子病毒可在外源
G
蛋白编码基因的帮助下复制
。
[0003]Michael A.Whitt
于
2010
年专利技术了
VSV
△
G
种子病毒的制备方法
。
首先构建
T7
噬菌体
RNA
聚合酶可工作的真核细胞，具体方法为构建可表达
T7 RNA
聚合酶的牛痘病毒，使用该病毒感染
BHK
细胞
。
随后，共转染5个质粒，包括含有
T7
启动子控制的
VSV N、P、L、G
蛋白编码基因的质粒各1个，
T7
启动子控制的
、G
蛋白编码基因缺陷的
VSV
基因组质粒1个
。
一定时间后，细胞培养上清中即含有
VSV
△
G
种子病毒
。
[0004]然而，
T7 RNA
聚合酶转录产生的
mRNA
不含有5’
帽结构，因此不能在真核细胞中正常翻译，导致效率较低
。
因此，需要牛痘病毒
(
内含加帽酶
)
的帮助
。
然而，牛痘病毒种子的获取较为困难，病毒的改造
、
扩增较为复杂，实验室需要申请该病毒的使用资质，以上均使
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒的获取十分复杂和困难
。
袁志刚等于
2005
年提出，构建
T7
噬菌体
RNA
聚合酶可工作的真核细胞理论上也可以借助于脑心肌炎病毒
(EMCV)
等的
IRES
序列来构建，这为绕开牛痘病毒提供了新的思路，不过技术上具体如何实现，现有技术中并未记载
。
[0005]有鉴于此，提出本申请
。
[0006]专利技术概述
[0007]针对上述技术问题，本申请通过锐意研究发现，通过本申请方法制备的
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒在假病毒制备领域具有着明显的技术优势
。
[0008]具体的，本申请提出如下技术方案：
[0009]本申请首先提供一种
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0010]1)
包装细胞构建：构建表达噬菌体
T7 RNA
聚合酶的细胞株；
[0011]2)
辅助质粒构建：分别构建
T7
启动子连接
VSV
病毒
N、P、L
或
G
蛋白编码基因的表达载体；
[0012]3)
基因组质粒构建：构建
T7
启动子接
VSV
病毒基因组的载体，所述
VSV
病毒基因组中的
G
蛋白编码基因被替换；
[0013]4)
种子病毒制备：将辅助质粒和基因组质粒导入步骤
1)
制备的包装细胞中，收获
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒
。
[0014]进一步的，上述方法还进一步包括如下步骤：
[0015]5)
种子病毒扩增：将步骤
4)
制备的
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒再次侵染原始细胞
株，同时添加
VSV
病毒
G
蛋白表达质粒；
[0016]进一步的，步骤
1)
中，所述细胞株为哺乳动物，包括但不限于
HEK 293
细胞株
、HeLa
细胞株
、Vero
细胞株；
[0017]优选的，所述构建的方式包括但不限于将
T7 RNA
聚合酶基因通过质粒瞬时转染或病毒载体导入到细胞株中；
[0018]进一步优选的，所述
T7 RNA
聚合酶基因连有启动子，所述启动子包括但不限于
CMV
或
CBV
启动子；
[0019]更进一步优选的，所述构建的具体步骤为：将
CMV
或
CBV
启动子连接
T7 RNA
聚合酶基因
CDS
序列，通过质粒瞬时转染或慢病毒载体导入
HEK 293
细胞株
、HeLa
细胞株或
Vero
细胞株
。
[0020]进一步的，步骤
2)
中，
[0021]所述
T7
启动子与蛋白编码基因之间连接有内部核糖体进入位点
(IRES)
序列；
[0022]优选的，所述
IRES
可操作的连接在
T7
启动子序列之后
。
[0023]进一步的，步骤
3)
中，
[0024]所述替换为将
VSV
病毒基因组中的
G
蛋白编码基因替换为报告基因，所述报告基因包括萤火虫萤光素酶报告基因
[0025]进一步的，步骤
4)
中，
[0026]所述收获为：培养1‑2天后，收取细胞培养上清，收获
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒
。
[0027]进一步的，步骤
5)
中，所述原始细胞株包括但不限于
HEK 293
细胞株
、HeLa
细胞株或
Vero
细胞株；所述
VSV
病毒
G
蛋白表达质粒为真核启动子连接
VSV
病毒
G
蛋白编码基因的表达质粒
。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)
包装细胞构建：构建表达噬菌体
T7 RNA
聚合酶的细胞株；
2)
辅助质粒构建：分别构建
T7
启动子连接
VSV
病毒
N、P、L
或
G
蛋白编码基因的表达载体；
3)
基因组质粒构建：构建
T7
启动子接
VSV
病毒基因组的载体，所述
VSV
病毒基因组中的
G
蛋白编码基因被替换；
4)
种子病毒制备：将辅助质粒和基因组质粒导入包装细胞中，收获
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒
。
优选的，所述方法还包括如下步骤：
5)
种子病毒扩增：将步骤
4)
制备的
VSV
△
G
复制缺陷型种子病毒再次侵染原始细胞株，同时添加
VSV
病毒
G
蛋白表达质粒
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤
1)
中，所述细胞株为哺乳动物细胞株，包括但不限于
HEK 293
细胞株
、HeLa
细胞株或
Vero
细胞株；优选的，所述构建的方式包括但不限于：将
T7 RNA
聚合酶基因质粒通过瞬时转染或病毒载体导入到细胞株中；更优选的，所述
T7 RNA
聚合酶基因连有启动子，所述启动子包括但不限于
CMV、CBV
启动子；进一步优选的，所述构建的具体步骤为：将
CMV
或
CBV
启动子连接
T7 RNA
聚合酶基因
CDS
序列，通过质粒瞬时转染或慢病毒载体导入
HEK 293
细胞株
、HeLa
细胞株或
Vero
细胞株
。3.
根据权利要求1‑2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤
2)
中，所述
T7
启动子与蛋白编码基因之间连接有内部核糖体进入位点
(IRES)
序列；优选的，所述
IRES
可操作的连接在
T7
启动子序列之后
。4.
根据权利要求1‑3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤
3)
中，所述替换为将
VSV
病毒基因组中的
G
蛋白编码基因替换为报告基因，所述报告基因包括但不限于萤火虫萤光素酶报告基因
。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张钘，曹宇慧，闫召璐，陈劲秋，任文林，
申请(专利权)人：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：