一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用技术

本申请涉及重组蛋白技术领域，具体公开了一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。先调取合成feld1 ch1，ch2和Linker基因序列，再融合连接PCR，之后以质粒pcDNA3.1(+)为载体构建表达载体，连接产物加入到TOP10感受态细胞中培养，收取菌体，提取质粒，基因转染HEK293细胞，表达，纯化，ELISA效价。本申请方法把复杂的天然提取变为快速，简洁，稳定的重组表达，并且获得与天然构象十分相似的目标蛋白，提高了过敏原的检测准确性。提高了过敏原的检测准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用
[0001]

[0002]本申请涉及重组蛋白
，更具体地说，它涉及一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0003]猫皮屑过敏原feld1是34kd二聚体蛋白，由ch1与ch2两条蛋白质链先串联再聚合而成，其蛋白质构象是如“蝴蝶状”的双链二聚体。蛋白在重组过程中大多以单链或双链单体形式存在，然而，具有天然状态的蛋白才能激发人体过敏反应。
[0004]当前医学过敏原检测原料大多为天然提取，从多种属猫皮屑中，对目标致敏蛋白进行多方式、多次的纯化分离。当前重组的feld1为单链或双链单体，与天然状态区别极大，很难形成具有生物学活性的“蝴蝶状”双链二聚体。
[0005]由于猫的种属限制，天然提取目标致敏蛋白含量及纯度都极低，且纯化过程繁琐，导致蛋白在纯化过程中降解失活，造成过敏原检测差异极大。同时，重组feld1为单链或双链单体形式对过敏人群IgE的反应极低。

技术实现思路

[0006]为了提高猫皮屑过敏原检测的准确性，降低天然过敏原提取的难度，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白、制备方法及应用。
[0007]第一方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，采用如下的技术方案：一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)制备串联体目标片段1.1调取合成feld1 ch1，ch2和Linker基因序列，序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；1.2融合连接PCR，获得ch2
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C4bpα
‑
ch1串联体目标片段，序列为SEQ ID NO.4；(2)构建表达载体1.1扩增酶切位点目标片段；1.2pcDNA3.1(+)质粒双酶切，连接目标片段；(3)蛋白表达连接产物加入到TOP10感受态细胞中培养，收取菌体，提取质粒；(4)ch2
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C4bpα
‑
ch1基因转染HEK293细胞，表达，纯化(5)ELISA效价。
[0008]优选的，所述步骤(2)以质粒pcDNA3.1(+)为载体构建表达载体。
[0009]优选的，所述步骤(3)加入到TOP10感受态细胞中，冰浴。
[0010]优选的，所述步骤(3)中的培养采用LB
‑
AG液体培养基。
[0011]优选的，所述步骤(4)中的纯化采用镍柱进行亲和层析。
[0012]第二方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，采用如下的技术方案：所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白，其氨基酸序列为：RGAVAVTAGVKMATCYDVAVANGNDSTKVNATRTAMKKDCYVNGSRVDGVMTTSSSKDCMGAVNTVDKNTGRMLGSQSISCSESGTWYPEVPRCEQEASEDLKPALTGMDAACTVAATADCCAVKRDVDTGTDYVVAYKAVVNARKNCVDAKMTDKNASDKYTSC。
[0013]优选的，构型是蝴蝶状的双链二聚体。
[0014]第三方面，本申请提供一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的用途，采用如下的技术方案：所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白在制备猫过敏检测试剂盒中的用途。
[0015]本专利技术以C4结合蛋白(C4bp)为基础开发多聚体的结构框架。C4bp是a血浆糖蛋白，由6
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7条相同的α
‑
链组成，α
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链的c端残基为541
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597。C4bp
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α含有2个半胱氨酸残基和一个两亲体α
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螺旋区，由于其自组装能力和独特的结构，通过发生1：1的二硫键配对，能够形成天然状态双链二聚体构象。
[0016]综上所述，本申请具有以下有益效果：1、本申请将医学过敏原检测原料从复杂的天然提取变为快速，简洁，稳定的重组表达，并且获得与天然构象十分相似的目标蛋白。
[0017]2、明确的过敏原组分检测是天然提取物很难做到的，使用本申请的重组蛋白的检测结果更加准确，稳定，更好的作为临床疫苗应用的伴随诊断。
[0018]说明书附图图1：分子克隆条带；图2：涂板结果；图3：蛋白表达SDS
‑
PAGE还原电泳；图4：效价验证；图5：临床检测结果图；图6：本申请方法流程图。
具体实施方式
[0019]实施例1调取、合成目标基因1.ch1目标基因(登录号NP_001041618.1)(SEQ ID NO.1)SEQ:ATGTTAGACGCAGCCCTCCCACCCTGCCCTACTGTTGCGGCCACAGCAGATTGTGA AATTTGCCCAGCCGTGAAGAGGGATGTTGACCTATTCCTGACGGGAACCCCCGACGAATATGTTGAGCAAGTGGCACAATACAAAGCACTACCTGTAGTATTGGAAAATGCCAGAATACTGAAGAACTGCGTTGATGCAAAAATGACAGAAGAGGATAAGGAGAATGCTCTCAGCTTGCTGGACAAAATATACACAAGTCCTCTGTGTAA:MDAACTVAATADCCAVKRDVDTGTDYVVAYKAVVNARKNCVDAKMTDKNASDKYT SC
2.Ch2目标基因(登录号NP_001041618.1)(SEQ ID NO.2)SEQ:AGGGGGGCACTGCTTGTGCTGGCATTGCTGGTGACCCAAGCGCTGGGCGTCAAGA TGGCGGAAACTTGCCCCATTTTTTATGACGTCTTTTTTGCGGTGGCCAATGGAAATGAATTACTGTTGGACTTGTCCCTCACAAAAGTCAATGCTACTGAACCAGAGAGAACAGCCATGAAAAAAATCCAGGATTGCTACGTGGAGAACGGACTCATATCCAGGGTCTTGGATGGACTAGTCATGACAACCATCAGCTCCAGCAAAGATTGCATGGGTGAAGCAGTTCAGAACACCGTAGAAGATCTCAAGCTGAACACTTTGGGGAGAAA:RGAVAVTAGVKMATCYDVAVANGNDSTKVNATRTAMKKDCYVNGSRVDGVMTTSSS KDCMGAVNTVDKNTGR3.Linker(C4bpαGenebank NM_001419982.1 541
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597AA)(SEQ ID NO.3)DNA:ATGCTGGGCAGCCAGAGCATTAGCTGCAGCGAAAGCGGCACCTGGTATCCGGAAG TGCCG CGCTGCGAACAGGAAGCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备串联体目标片段a、调取合成feld1 ch1，ch2和Linker基因序列，序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；b、融合连接PCR，获得ch2
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C4bpα
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ch1串联体目标片段，序列为SEQ ID NO.4；（2）构建表达载体a、扩增酶切位点目标片段；b、pcDNA3.1(+)质粒双酶切，连接目标片段；（3）蛋白表达连接产物加入到 TOP10感受态细胞中培养，收取菌体，提取质粒；（4）ch2
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C4bpα
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ch1基因转染HEK293细胞，表达，纯化；（5）ELISA效价。2.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）以质粒pcDNA3.1(+)为载体构建表达载体。3.根据权利要求1所述的猫皮屑过敏原组分feld1双链二聚体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）加入到TOP10感受...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宁，于清华，李滨雁，
申请(专利权)人：山东立菲生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：