快速构建猪伪狂犬病毒PRVCH-17gI/gE双基因缺失株重组转移载体的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH

【技术实现步骤摘要】
快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
‑
17 gI/gE双基因缺失株重组转移载体的方法


[0001]本专利技术属于生物技术基因工程领域，具体涉及一种用于快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
‑
17 gI/gE双基因缺失株重组转移载体的方法。

技术介绍

[0002]伪狂犬病是以伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)为病原引起牛、羊等多种家畜及狐狸、貂等野生动物发生奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎、高热等症状的疾病。
[0003]目前对该病的防控主要通过疫苗接种方式。从2011年底以来，PRV变异株导致的伪狂犬病疫情在国内爆发，接种过经典毒株疫苗的猪场也有发生感染。由于PRV新流行毒株的抗原性已发生变异，其致病力和传播能力显著增强，传统的经典毒株疫苗的免疫效果不佳，已不能有效防控当前PRV变异毒株的感染，因此开发更加安全、免疫效果好的疫苗对于该病的防控显得尤为重要。
[0004]基因缺失疫苗是当前防治伪狂犬病的重要方法之一。通过基因工程技术以同源重组的方法将病毒的毒力有关的基因或基因片段定向除去从而获得伪狂犬病毒的基因缺失株，该类缺失疫苗具有能够稳定遗传、安全性能好、出现返毒可能性小等优点。
[0005]用于伪狂犬病毒基因缺失的技术有多种，包括构建同源转移载体和基因组的BAC载体(细菌人工染色体)等方法。但由于基因组的BAC化较难，且病毒基因组在细菌内不稳定。所以仍以构建同源转移载体为主要的方法。
[0006]同源转移载体通过将同源转移质粒和伪狂犬病毒基因组共转染至传代细胞，能够获得定向重组病毒。该方法简单快捷，且精准，但需要构建同源转移载体。一般的转移载体构建需要一个个片段的连接到转移载体上，构成含荧光标记基因的转移载体，然后构建不含荧光标记基因的转移载体，这种方法费时费力。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
‑
17 gI/gE双基因缺失株重组转移载体的方法。
[0008]为了实现以上目的，本专利技术提供了一种快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
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17 gI/gE双基因缺失株载体的方法，该方法包括以下步骤：
[0009](1)PCR扩增以下特异目的片段：以伪狂犬病毒PRV CH
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17的DNA作为模板，分别PCR扩增gI/gE基因上游同源臂、gI/gE基因下游同源臂和EGFP表达盒；
[0010](2)通过连接酶，将回收的PCR产物与经限制酶Hind III和Xba I双酶切线性化的载体pcDNA3.1(+)以各目的片段与载体摩尔比3:1于16℃连接5小时，构建含荧光标记基因的重组转移载体pcDNA
‑
IEE；
[0011](3)通过限制酶KpnⅠ将构建好的转移载体pcDNA
‑
IEE进行单酶切，以去掉EGFP表达盒，酶切产物电泳、胶回收，再用DNA Ligation Kit进行自身环化，16℃连接30min，构建gI/
gE双基因缺失转移载体pcDNA
‑
IE。
[0012]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增所述gI/gE基因上游同源臂所使用的引物如下：
[0013]IEU
‑
F：TAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCGGGACCATCGAGACCAACG；
[0014]IEU
‑
R：TAATAACTAGGTACCGCTTCATGCCGCAGGGGTAGTC。
[0015]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增所述gI/gE基因下游同源臂所使用的引物如下：
[0016]IED
‑
F：TCTTAACGCGGTACCGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTG；
[0017]IED
‑
R：GTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGGTGGTGATGTAGAACGGC。
[0018]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增所述EGFP表达盒所使用的引物如下：
[0019]egfp
‑
F：CCTGCGGCATGAAGCGGTACCTAGTTATTAATAGTAA；
[0020]egfp
‑
R：AGCACAAACAGCCGCGGTACCGCGTTAAGATACATTG。
[0021]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，所述gI/gE基因上游同源臂5
′
端添加了酶切位点HindIII及载体pcDNA3.1(+)部分重叠区域，3
′
端添加了酶切位点Kpn I及EGFP表达盒部分重叠区域；所述gI/gE基因下游同源臂5
′
端添加了酶切位点Kpn I及EGFP表达盒部分重叠区域，3
′
端添加了酶切位点Xba I及载体pcDNA3.1(+)部分重叠区域；所述EGFP表达盒5
′
端添加了酶切位点Kpn I及上游同源臂部分重叠区域，5
′
端添加了酶切位点Kpn I及下游同源臂部分重叠区域。
[0022]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增反应体系如下：模板DNA 1μg，浓度为10μmol/L的上下游引物2.5μL，2
×
UltraHiFi Mix 25μL，PCR M 10μL，ddH2O补足至50μL。
[0023]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增gI/gE基因上游同源臂的反应程序如下：94℃，5min；98℃，10s，65℃，30s，68℃，30s，30个循环；68℃，5min。
[0024]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增gI/gE基因下游同源臂的反应程序如下：94℃，5min；98℃，10s，68℃，30s，30个循环；68℃，5min。
[0025]作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)中，PCR扩增EGFP表达盒的反应程序如下：94℃，5min；98℃，10s，60℃，30s，68℃，30s，30个循环；68℃，5min。
[0026]本方法步骤简单，操作简便，能够快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
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17 gI/gE双基因缺失株的重组转移载体，从而应用于伪狂犬gI/gE双基因缺失毒株的制备。
附图说明
[0027]图1是根据本专利技术的猪伪狂犬病毒PRV CH
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17 gI/gE双基因缺失株的重组转移载体构建流程的示意图。
[0028]图2是转移载体pcDNA
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IEE的双酶切鉴定结果。
[0029]图3是转移载体pcDNA
‑
IEE的转染结果。
[0030]图4是转移载体pcD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速构建猪伪狂犬病毒PRV CH
‑
17 gI/gE双基因缺失株载体的方法，包括以下步骤：(1)PCR扩增以下特异目的片段：以伪狂犬病毒PRV CH
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17的DNA作为模板，分别PCR扩增gI/gE基因上游同源臂、gI/gE基因下游同源臂和EGFP表达盒；(2)通过连接酶，将回收的PCR产物与经限制酶Hind III和Xba I双酶切线性化的载体pcDNA3.1(+)以各目的片段与载体摩尔比3:1于16℃连接5小时，构建含荧光标记基因的重组转移载体pcDNA
‑
IEE；(3)通过限制酶Kpn
ꢀⅠ
将构建好的转移载体pcDNA
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IEE进行单酶切，以去掉EGFP表达盒，酶切产物电泳、胶回收，再用DNA Ligation Kit进行自身环化，16℃连接30min，构建gI/gE双基因缺失转移载体pcDNA
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IE。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，PCR扩增所述gI/gE基因上游同源臂所使用的引物如下：IEU
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F：TAGCGTTTAAACTTAAGCTTGCCGGGACCATCGAGACCAACG；IEU
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R：TAATAACTAGGTACCGCTTCATGCCGCAGGGGTAGTC。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，PCR扩增所述gI/gE基因下游同源臂所使用的引物如下：IED
‑
F：TCTTAACGCGGTACCGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTG；IED
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R：GTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGGTGGTGATGTAGAACGGC。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，PCR扩增所述EGFP表达盒所使用的引物如下：egfp
‑
F：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴春琼，陈芳，邓桦，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：