一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用技术

本申请公开了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用，所述方法通过基因克隆技术特别设计开发特定CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α‑factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用
本申请属于生物
，特别涉及一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
C-反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP蛋白)是一种典型的急性期血浆蛋白，由于其血浆浓度在响应炎症反应时能够从基线低浓度(＜1μg/mL)迅速增加1000倍以上，因此，长期以来作为临床上炎症反应的非特异性标示物。图1示出天然CRP蛋白的结构示意图，如图1所示，天然CRP蛋白由五个相同的亚单位以非共价键形式结合成对称的五聚体，其相对分子质量为115kD，具体地，五个亚单位聚合形成环状结构，在酸性或碱性环境中，天然的CRP蛋白可分解为五个单体，每个单体即为一个亚单位。天然CRP蛋白的每个亚单位具有206个氨基酸残基，相对分子质量为23kD。天然CRP蛋白中每个亚单位均含有磷酸胆碱结合位点，如图1中第一球系(1)圆球区域所示，进一步地，每个亚单位上临近疏水口袋的位置均有两个钙离子结合位点，如图1中磷酸胆碱旁边的第二球系(2)所示，并且，所有亚单位的磷酸胆碱结合位点均位于天然CRP蛋白环状结构的同侧，将天然CRP蛋白上存在磷酸胆碱结合位点的一面称为识别面，与识别面相对的面称为效应面，所述效应面可与效应因子结合，由于所述效应因子由炎症反应而产生，因此，可据CRP蛋白上是否结合有效应因子来判断供样机体是否存在炎症反应，其中，所述效应因子可以为补体成分C1q或者细胞表面Fcy受体。目前常采用免疫分析法来检测血浆中CRP蛋白含量，因此，需使用大量高质量的标准品作为对照，作为对照的CRP蛋白质需要活性高、稳定性好，经过长时间贮存而活性几乎无下降。目前市售的CRP蛋白标准品的来源多样，例如，来自大肠杆菌系统表达而得，或者，由患者CRP阳性胸腹水中天然提取。一般地，高品质CRP蛋白来源于天然提取，但是，由于天然提取的CRP蛋白价格昂贵，并且，原料来源并不完全稳定，严重阻碍CRP蛋白标准品等诊断产品的研究开发，因此，科研人员转向利用基因工程研发大量生产CRP的方法。CRP编码基因，即，用于编码CRP蛋白的基因，属于穿透素家族成员之一，位于人类1号染色体q23区域，其基因序列高度保守。现有技术中存在以色氨酸启动子、CRP编码基因、Kil基因以及来自于大肠杆菌ALP区域的信号肽融合构建重组质粒，再通过在E.coliNM522菌株中成功分泌表达CRP蛋白的方法，该方法通过发酵罐发酵可达到30mg/L的高表达量，进一步地，使用ECH-Sepharose4B成功纯化CRP蛋白。但是，大肠杆菌系统表达的CRP蛋白结构较为单一，可能出现蛋白折叠不正确或者糖基化不完全的情况，进而会导致CRP蛋白活性不足或者稳定性不足。因此，科研人员期待在真核酵母系统中制备CRP蛋白，从而获得满足使用要求的CRP蛋白。现有技术中存在将人源CRP编码基因克隆构建到甲醇酵母表达载体pPICZαA上，在甲醇诱导表达菌株X-33中利用甲醇诱导进行分泌表达的方法，并且，利用组氨酸标签进行亲和层析纯化rhCRP。但是，利用甲醇诱导型载体不仅需要在菌体培养过程中进行培养基换液，还需要补加诱导剂甲醇，上述操作容易造成杂菌污染，特别地，如果需要进行发酵罐发酵培养，则上述因素均容易造成经济损失。
技术实现思路
为解决上述问题中的至少一个，本申请提供了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法利用融合有CRP编码基因的重组质粒在毕赤酵母GS115菌株中分泌表达制备CRP蛋白的方法。本申请的目的在于提供一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，所述方法包括：步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子进行自诱导表达CRP蛋白。优选地，所述的CRP蛋白编码基因，包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：(1’)如SEQIDNo.1所示的DNA分子；(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或者，所述CRP蛋白为将SEQIDNo.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白；(3’)与(1’)或者(2’)所述DNA分子具有90％以上同一性，并且编码所述CRP蛋白的DNA分子。本申请所提供的编码基因为优化的人源CRP编码基因，能够在酵母系统，特别是毕赤酵母系统中表达。进一步地，所述pAO815Gα载体由pAO815载体与GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因构建而成。本申请人发现，利用pAO815Gα载体与所述CRP编码基因融合，能够使所述CRP编码基因的发酵条件下充分在胞外表达，将CRP蛋白表达于发酵体系的上清液中，便于CRP蛋白的收集和利用。进一步地，利用所述pAO815Gα载体能够避免甲醇的使用，一方面能够消除甲醇由于易燃易爆等化学性质而带来安全隐患，另一方面还能够避免甲醇由于基本身的毒性而带来的潜在危险。可选地，在步骤5后，所述方法还可以包括以下步骤：步骤6，根据步骤5各单克隆转化子的表达活性浓度，筛选目标单克隆转化子，并利用所筛选的目标单克隆转化子制备一级种子液。可选地，在步骤6之后，所述方法还可以包括以下步骤：步骤7，利用所述一级种子液制备二级种子液。可选地，在步骤7之后，所述方法还可以包括以下步骤：步骤8，利用所述二级种子液发酵制备CRP蛋白。可选地，在步骤8之后中，所述方法还可以包括以下步骤：步骤9，将步骤8制备所得的CRP蛋白进行纯化。在本申请中，特别地，使用ECH填料柱对CRP蛋白进行纯化，本申请人发现，ECH填料中的游离羧基基团与CRP蛋白上的钙离子结合，将CRP蛋白吸附于层析柱上，再使用螯合剂将CRP蛋白从层析柱上洗脱下，所获得的CRP蛋白纯度较高。第二方面，一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括由上述制备方法所得到的CRP蛋白。第三方面，利用第一方面所述方法制备所得的CRP蛋白用于制备CRP蛋白标准品的应用。与现有技术相比，本申请提供的方案利用基因工程大量生产重组CRP蛋白的方法，具体地，通过基因克隆技术特别设计开发了一种CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α-factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。本申请提供的方法避免AOX启动子，因此，有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：/n步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；/n步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；/n步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；/n步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；/n步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子自诱导表达CRP蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：
步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；
步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；
步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；
步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；
步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子自诱导表达CRP蛋白。


2.根据权利要求1所述的一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述CPR编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：
(1’)如SEQIDNo.2所示的DNA分子；
(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo....

【专利技术属性】
技术研发人员：郝鹏，黄芳，王彩虹，徐智盼，
申请(专利权)人：南京基蛋生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32