一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用技术

本申请公开了一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用，所述方法通过基因克隆技术特别设计开发特定CRP编码基因，并以pAO815为模板进行改造构建自诱导分泌表达酵母载体，将所述CRP编码基因克隆至改造后含有GAP启动子及α‑factor分泌信号肽基因的pAO815载体上，并完成四拷贝重组质粒的筛选以及单克隆转化子的筛选，再运用发酵罐技术完成CRP蛋白的分泌表达，最终通过ECH填料纯化，得到纯度高于90％的CRP蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用
本申请属于生物
，特别涉及一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
C-反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP蛋白)是一种典型的急性期血浆蛋白，由于其血浆浓度在响应炎症反应时能够从基线低浓度(＜1μg/mL)迅速增加1000倍以上，因此，长期以来作为临床上炎症反应的非特异性标示物。图1示出天然CRP蛋白的结构示意图，如图1所示，天然CRP蛋白由五个相同的亚单位以非共价键形式结合成对称的五聚体，其相对分子质量为115kD，具体地，五个亚单位聚合形成环状结构，在酸性或碱性环境中，天然的CRP蛋白可分解为五个单体，每个单体即为一个亚单位。天然CRP蛋白的每个亚单位具有206个氨基酸残基，相对分子质量为23kD。天然CRP蛋白中每个亚单位均含有磷酸胆碱结合位点，如图1中第一球系(1)圆球区域所示，进一步地，每个亚单位上临近疏水口袋的位置均有两个钙离子结合位点，如图1中磷酸胆碱旁边的第二球系(2)所示，并且，所有亚单位的磷酸胆碱结合位点均位于天然CRP蛋白环状结构的同侧，将天然CR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：/n步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；/n步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；/n步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；/n步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；/n步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子自诱导表达CRP蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：
步骤1，将CRP蛋白编码基因克隆至pAO815Gα载体中构建单拷贝重组质粒；
步骤2，利用步骤1获得的单拷贝重组质粒获得四拷贝重组质粒；
步骤3，将步骤2所得四拷贝重组质粒进行线性化处理，获得线性化重组质粒；
步骤4，将步骤3获得的线性化重组质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中；
步骤5，从步骤4获得的体系中挑取单克隆转化子，培养所述单克隆转化子自诱导表达CRP蛋白。


2.根据权利要求1所述的一种诊断试剂用重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述CPR编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：
(1’)如SEQIDNo.2所示的DNA分子；
(2’)在严格条件下与(1’)所示DNA分子杂交，并且编码CRP蛋白的DNA分子，其中，所述CRP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo....

【专利技术属性】
技术研发人员：郝鹏，黄芳，王彩虹，徐智盼，
申请(专利权)人：南京基蛋生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32