人FOXP3在经基因编辑的T细胞中的表达制造技术

本文所述的发明专利技术的方面涉及将FOXP3 cDNA(例如全长人密码子优化的)靶向至FOXP3基因座或非FOXP3基因座，从而在原代人淋巴细胞中提供组成型或调控型FOXP3表达。本文所述的组合物和材料为鼠、非人灵长类动物或人FOXP3的CRISPR/Cas介导的基因调控提供特异性。将向导RNA序列用于靶向FOXP3、AAVS1和其它候选基因座以用于CRISPR/Cas介导的基因调控，并提供了用于基于HDR的基因修饰的基因递送盒。本文所述的替代组合物能够以核糖核蛋白(RNP)的形式递送，并且可以用于靶向人和/或非人灵长类动物FOXP3。试剂由新型向导RNA序列组成，并可与Cas蛋白和新型基因递送盒(包含FOXP3 cDNA+/‑其它顺式连接的基因产物)组合，产生高频率的中靶切割。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人FOXP3在经基因编辑的T细胞中的表达相关申请的交叉引用本申请要求2018年4月27日提交的、名称为“在经基因编辑的T细胞中从非FOXP3或FOXP3遗传基因座进行的编码人FOXP3的mRNA的表达”的美国临时申请No.62/663,561以及2018年11月30日提交的、名称为“人FOXP3在经基因编辑的T细胞中的表达”的美国临时申请No.62/773,414的优先权，出于所有目的，以引用的方式将它们各自整体并入。序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表作为题为SCRI187WOSEQLIST的文件而提供，创建于2019年4月25日，大小约为496Kb。以引用的方式将序列表的电子格式中的信息整体并入本文。
本文所述的专利技术的方面涉及将FOXP3编码序列并入淋巴细胞性细胞(lymphocyticcells)中的FOXP3基因座或非FOXP3基因座中，以在经编辑的淋巴细胞性细胞(如T细胞)中提供组成型或调控型FOXP3表达。
技术介绍
FOXP3(也称为叉头框蛋白P3(forkheadboxproteinP3)、叉头框P3(forkheadboxP3)、AAID、DIETER、IPEX、JM2、PIDX、XPID或scurfin)的慢病毒基因转移先前已由Chen，C.等(2011).Transplant.Proc.43(5)：2031-2048，Passerini，L.等(2013).Sci.Transl.Med.，5(215)：215ra174以及Passerini，L.等(2017).Front.Immunol.8：1282进行了描述；以引用的方式明确地将它们的整体内容各自并入本文。Passerini等(2017)先前报道了在来自携带FOXP3突变的患者的T淋巴细胞中恢复Treg功能的方法的开发。如Passerini等(2017)所述，将慢病毒介导的基因转移用于CD4+T细胞和效应T细胞(它们被转化为表现出Treg样细胞的特征的调节性T细胞)，并赋予细胞有效的体外和体内阻抑活性。Passerini等(2013)还证明了在慢病毒介导的FOXP3基因转移后，CD4+T细胞向Treg细胞转化，其中所述细胞在炎症条件下显示是稳定的。Chen等(2011)也描述了工程化T细胞的过继转移，其中用编码FOXP3-IRES-GFP片段的慢病毒载体感染T细胞。在鼠模型中显示这些细胞保护受体免受GVHD。显现出在原代人淋巴细胞中表达和调控FOXP3的新方法的需求。由于调节性T细胞诱导抗原特异性耐受性的可能性，许多研究者对用这些细胞治疗自身免疫性疾病感兴趣。存在许多形式的调节性T细胞(“Tregs”)，目前的命名法将Tregs分为在T细胞发育过程中在胸腺中产生的Tregs(表示为胸腺调节性T细胞或“tTregs”)以及外周诱导型调节性T细胞(表示为外周调节性T细胞或“pTregs”)。调节性T细胞生物学的关键方面是转录因子FOXP3(也称为叉头框蛋白P3、叉头框P3、AAID、DIETER、IPEX、JM2、PIDX、XPID和scurfin)的表达。FOXP3被认为是指定调节性T细胞谱系所必需的。这一观念是基于观察到缺乏FOXP3的人从新生儿阶段开始发展出严重的自身免疫性疾病。由于认为FOXP3表达受表观遗传调节的支配，使用tTregs或pTregs治疗自身免疫性疾病可能不是最佳的。在tTregs中，FOXP3基因中的上游区域(称为“胸腺特异性去甲基化区域”)被完全去甲基化，认为该状态导致稳定的FOXP3表达。通常，在pTregs中未观察到完全去甲基化。在炎症条件下，FOXP3会在pTregs以及可能的tTregs中表观遗传沉默，这潜在地导致pTregs向促炎性CD4+T细胞转化。pTregs的稳定性缺乏是一个重要的问题，因为回返炎性表型的pTregs的输注的使用可能加重自身免疫性症状。但是，许多利用慢病毒构建体的方法导致随机整合到细胞基因组中，这会潜在地破坏肿瘤阻抑基因或激活原癌基因。此外，整合位点可能位于以不良表达为特征的基因组区域中，因此无法引起FOXP3的稳定表达。
技术实现思路
本专利技术的一个方面是一种系统，所述系统包含：脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述gRNA包含与淋巴细胞性细胞(例如T细胞)中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区(spacer)序列；以及供体模板，所述供体模板包含编码FOXP3蛋白或其功能衍生物的核酸序列。在一些实施方式中，所述gRNA包含：i)来自SEQIDNO：1-SEQIDNO：7、SEQIDNO：15-SEQIDNO：20、SEQIDNO：27-SEQIDNO：29、SEQIDNO：33和SEQIDNO：34中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO：1-SEQIDNO：7、SEQIDNO：15-SEQIDNO：20、SEQIDNO：27-SEQIDNO：29、SEQIDNO：33和SEQIDNO：34中的任一项相比具有不超过3个错配；ii)来自SEQIDNO：1-SEQIDNO：7中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO：1-SEQIDNO：7中的任一项相比具有不超过3个错配；或者iii)来自SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：5中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO：2、SEQIDNO：3和SEQIDNO：5中的任一项相比具有不超过3个错配。在一些实施方式中，所述FOXP3或其功能衍生物是野生型人FOXP3。在一些实施方式中，所述DNA核酸内切酶是Cas核酸内切酶。在一些实施方式中，所述DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施方式中，编码所述DNA核酸内切酶的核酸是mRNA。在一些实施方式中，在腺相关病毒(AAV)载体中编码所述供体模板。在一些实施方式中，将所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸配制到脂质体或脂质纳米颗粒中。本文还描述了一种在淋巴细胞性细胞中编辑基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供本文所述系统中的任一种。在一些实施方式中，所述细胞不是生殖细胞。本公开还描述了一种经基因修饰的淋巴细胞性细胞以及包含经基因修饰的淋巴细胞性细胞的组合物，其中，所述细胞的基因组被本文所述方法中的任一种编辑。本文进一步描述了一种在受试者中治疗与FOXP3相关的疾病或病症(condition)的方法，所述方法包括向所述受试者中的淋巴细胞性细胞提供本文所述系统中的任一种。所述疾病或病症可为炎性疾病或自身免疫性疾病，例如IPEX综合征或移植物抗宿主病(GVHD)。一些实施方式包括用于在受试者中治疗与FOXP3相关的疾病或病症的药物。更多实施方式涉及经基因修饰的淋巴细胞性细胞，其中通过本文所述方法中的任一种对细胞的基因组进行编辑，以用于抑制或治疗与FOXP3相关的疾病或病症，例如炎性疾病或自身免疫性疾病，如IPEX综合征本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种系统，所述系统包含：/n脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；/n向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述gRNA包含与淋巴细胞性细胞中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区序列；以及/n供体模板，所述供体模板包含编码FOXP3或其功能衍生物的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 US 62/663,561;20181130 US 62/773,4141.一种系统，所述系统包含：
脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；
向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述gRNA包含与淋巴细胞性细胞中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区序列；以及
供体模板，所述供体模板包含编码FOXP3或其功能衍生物的核酸序列。


2.如权利要求1所述的系统，其中，所述gRNA包含：
i)来自SEQIDNO:1-SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-SEQIDNO:20、SEQIDNO:27-SEQIDNO:29、SEQIDNO:33和SEQIDNO:34中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO:1-SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-SEQIDNO:20、SEQIDNO:27-SEQIDNO:29、SEQIDNO:33和SEQIDNO:34中的任一项相比具有不超过3个错配；
ii)来自SEQIDNO:1-SEQIDNO:7中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO:1-SEQIDNO:7中的任一项相比具有不超过3个错配；或者
iii)来自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中的任一项相比具有不超过3个错配。


3.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述FOXP3或其功能衍生物是野生型人FOXP3。


4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述DNA核酸内切酶是Cas核酸内切酶。


5.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。


6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸是mRNA。


7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，在腺相关病毒(AAV)载体中编码所述供体模板。


8.如权利要求1-7中任一项所述的系统，其中，所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的所述核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。


9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒还包含所述gRNA。


10.一种在淋巴细胞性细胞中编辑基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供如下：
(a)gRNA或编码所述gRNA的核酸，所述gRNA包含与所述细胞中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区序列；
(b)DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；以及
(c)供体模板，所述供体模板包含编码FOXP3或其功能衍生物的核酸序列。


11.如权利要求10所述的方法，其中，所述gRNA包含：
i)来自SEQIDNO:1-SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-SEQIDNO:20和SEQIDNO:27-SEQIDNO:29中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO:1-SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-SEQIDNO:20和SEQIDNO:27-SEQIDNO:29中的任一项相比具有不超过3个错配；
ii)来自SEQIDNO:1-SEQIDNO:7中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SEQIDNO:1-SEQIDNO:7中的任一项相比具有不超过3个错配；或者
iii)来自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中的任一项的间隔区序列或其变体，所述变体与SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·M·沙尔博格，戴维德·J·罗林斯，凯伦·索默，玉池·蒋·霍纳克，伊拉姆·F·卡恩，特洛伊·托格森，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US