慢性疾病如HIV感染和癌症中存在的主要免疫功能障碍是T细胞能动性和向组织迁移的障碍。诸如抗逆转录病毒疗法或癌症疗法等疗法往往不能完全恢复T细胞对组织迁移和浸润的能动性。Cofilin是一种Actin解聚因子，调节T细胞迁移的Actin动态变化。我们证明T细胞(CD4和CD8)、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞,和/或癌症细胞的cofilin磷酸化水平可以用来量化免疫损害引起的慢性病毒感染和癌症,并预测T细胞治疗后的恢复。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用COFILIN磷酸化定量检测CD4T细胞损伤和预测抗逆转录病毒治疗后CD4T细胞恢复交叉引用相关申请本申请明确了美国临时申请编号62/620,598专利的优先收益权，该专利于2018年1月23日提交，其内容在此作为整体参考纳入本申请书。
技术介绍
抗逆转录病毒疗法(ART)显著延长了艾滋病毒感染者的寿命，但既不能治愈，也不能完全恢复免疫。HIV感染的自然过程会导致多种CD4T细胞缺陷(1)，包括T细胞迁移及向肠相关淋巴组织(GALT，Gut-Associatedlymphoidtissue)等的归巢障碍(2-4)。即使通过抗逆转录疗法(ART)抑制了病毒，CD4T细胞还是无法在淋巴组织中重分布(2,3,5,6)，由此造成的免疫损伤及重建不良会影响长期的病毒抑制(7)。HIV感染者外周循环中大多数CD4T细胞没有感染HIV病毒(每百万0.2-16.4个HIV+细胞)(8)。因此，患者的T细胞迁移缺陷可能是由病毒(9,10)和/或炎症因子的慢性刺激和受体信号传导的旁观者效应造成的(1,2)。然而，造成这种持续的T细胞功能障碍的分子机制尚未阐明。这阻碍了通过恢复T细胞功能，实现持续免疫控制和清除艾滋病毒的有效疗法的发展。在癌症中，T细胞的迁移和浸润也有类似的损伤(11)。CD8T细胞等T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，但肿瘤可以通过各种防御机制直接或间接地抑制T细胞向肿瘤床的迁移，从而进行免疫控制(11)。在人体免疫系统中，T细胞的活性主要由受体信号调节。趋化受体(如趋化因子受体、细胞因子受体、整合素受体、黏附分子受体和共刺激分子受体如CD28、CTLA-4和PD-1/PD-L)的持续刺激及信号传导通常会导致T细胞极化和分化。在HIV感染中，病毒通过gp120结合CD4和趋化因子共受体CXCR4(X4)或CCR5(R5)从而感染T细胞(12,13)。这种结合也会引发异常信号传导，并造成病理性改变(9,10,14,15)。HIV通过与CXCR4结合可以激活肌动蛋白(Actin)结合因子cofilin动态变化，从而促进病毒在静息CD4T细胞中的入核过程(9,16)。类似地，在其他慢性疾病，如癌症中，免疫细胞受到高水平炎症趋化因子(如IP-10)和肿瘤抗原的持续刺激，从而导致T细胞极化和功能障碍，并损害T细胞运动能力(图1)。Cofilin是控制T细胞运动和迁移的主要细胞蛋白，它是Actin结合蛋白，属ADF/Cofilin家族蛋白，广泛存在于真核生物中。ADF/cofilin蛋白以PH依赖方式结合和解聚F-Actin，调控细胞Actin动态变化。第一个ADF/cofilin家族蛋白是从鸡胚脑中鉴定出来(19)。Cofilin是从猪脑中纯化出，并因与Actin结合的结构而被命名，简称为Cofilin。目前，ADF/cofilin家族包含三种高度保守的蛋白：ADF(Actin解聚因子)或destrin，cofilin1(non-musclecofilin或cofilin)和cofilin-2(muscle-cofilin)。人cofilin含有166个氨基酸，分子量为18kD(20)。从结构上看，人类cofilin含有一个由β1到β5组成的核心。其中β1到β4反相平行，β5与β4平行，与β3反向平行。而且，C末端剩余的159-161，氨基酸组成了β6。五个螺旋结构α1到α5环绕区，His133和Asp98中间形成盐桥，可通过改变cofilin的PH敏感性影响Actin聚合及解聚。Cofilin结合G-actin，结合位点位于Tyr117周围，这里包括几个α4残基(Lys112，Lys114，Met115，Ile124)及β5。此外，一些其他的残基如Ile12、Pro110和Leu128也被提示与G-actin结合有关。Cofilin还可与F-actin结合，这需要在Cofilin上有两个位点，一个G位点与Actin子域1和3相互作用，另一个F位点与Actin子域1和2相互作用。通过突变确认了与F-actin结合的cofilin残基，包括β4(Lys96及Asp98)及α5(Glu151，Lys152，Gly155)。其他区域，如β3及β5也可能参与了cofilin与F-actin的结合(21)。Cofilin通过两种机制解聚Actin：直接切断Actin亚基和加速Actin(-)端脱落(22,23)。Cofilin对ADP-actin的亲和力高于对ATP-actin，并且Cofilin与Actin微丝的结合可以促进ATP-actin上的磷酸解离。ATP的水解增加了cofilin的结合亲和力，改变了Actin螺旋的扭曲，将Actin切断为更短的片段(24)。这些切断的Actin可以提供更多的自由(+)端供Arp2/3复合物成核(25)，从而提高Actin聚合的速度。Cofilin与ADP-actin(-)末端的结合也促进了cofilin-ADP-actin的解离。在释放的ADP-actin复合物中，Cofilin竞争性地被profilin所取代，然后将ADP-actin单体转化为ATP-actin单体，并在(+)末端回收它们进行新的actin聚合。因此，我们认为cofilin和Arp2/3复合物共同调控Actin踏板运动，ATP-actin优先通过Arp2/3在(+)末端进入微丝，然后被cofilin水解为“较老”的ADP-actin，并被cofilin从(-)末端分离(23,26)。在细胞中，cofilin的活性主要通过n端丝氨酸3(Ser3)的磷酸化来调节，抑制了cofilin与G-actin和F-actin的结合。负责cofilin丝氨酸3磷酸化的激酶是LIM域激酶(LIMK)和Tes激酶，它们是Rho家族GTPases如Rho、Rac和Cdc42的靶点(27)。Rho家族GTPases激活PAK1、PAK2、PAK4、ROCK及MRCK(myotonicdystrophykinase-relatedCdc42-bindingproteinkinase)然后通过磷酸化直接激活LIMK。磷酸化酶PP1、PP2A、slingshotIL(SSH1L)和chronophin等使Ser3去磷酸化，从而激活Cofilin，这些酶将Cofilin的活性与不同的信号通路结合(28-30)。最近的研究表明，酪氨酸68(Y68)也可以被磷酸化，而这种磷酸化可以增加cofilin泛素化和蛋白酶体降解(31)。在趋化细胞中，cofilin磷酸化和去磷酸化周期维持Actin动态变化从而定向驱动细胞迁移。在细胞中，cofilin是Actin动态的关键调节因子，并参与多种细胞过程(32)。cofilin调节Actin聚合或解聚的能力取决于cofilin的局部浓度。低浓度的cofilin有利于分离，而高浓度的cofilin有利于Actin成核。然而，尚不清楚在细胞中这种体外浓度依赖模型是否成立(33)。总的来说，通过siRNA降低cofilin的表达会增加细胞Actin数量，而过表达cofilin则会诱导形成cofilin-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测和治疗患者免疫功能障碍的方法，包括/n(a)定量患者T细胞(CD4/CD8)、单核/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或癌细胞中cofilin磷酸化水平，其中免疫功能障碍患者的cofilin磷酸化水平低于或高于对照组健康人或患者；/n(b)给予患者纠正cofilin失调和恢复cofilin磷酸化的适量药物组合。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180123 US 62/620,5981.一种检测和治疗患者免疫功能障碍的方法，包括
(a)定量患者T细胞(CD4/CD8)、单核/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或癌细胞中cofilin磷酸化水平，其中免疫功能障碍患者的cofilin磷酸化水平低于或高于对照组健康人或患者；
(b)给予患者纠正cofilin失调和恢复cofilin磷酸化的适量药物组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者为慢性疾病造成免疫功能障碍的患者。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢性疾病为HIV感染或癌症。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫功能包括T细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞的异常活化、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、NK细胞的运动性和/或组织迁移。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合为cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物组合包括okadaicacid。
7.一种定量检测患者免疫功能障碍的方法，包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴云涛，尚红，傅雅静，
申请(专利权)人：富荣吉有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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