一种卵母细胞体外成熟培养方法技术

本发明专利技术公开了一种卵母细胞体外成熟培养方法。一种卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于使用包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF‑CO3的卵母细胞体外成熟培养试剂对卵母细胞进行体外培养或者在卵母细胞体外成熟培养液中添加氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF‑CO3。小鼠GV期卵细胞培养液中加入PDFF‑CO3，有促进卵细胞成熟的生物学功能；因此，PDFF‑CO3可以在制备促进卵细胞成熟及提高卵细胞发育潜能的药物、制备培养液中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种卵母细胞体外成熟培养方法分案说明本专利技术是申请日为2019-9-3,申请号为2019108274356,专利技术名称为一种分泌型内源性多肽PDFF-CO3及其应用的中国专利技术专利申请的分案申请.
本专利技术属于辅助生殖
，涉及一种分泌型内源性多肽PDFF-CO3及其应用。
技术介绍
卵母细胞体外成熟培养(IVM)是一种在不经超排卵或应用少量Gn后，从卵巢获取未成熟卵母细胞，在体外适应的条件下进行培养，使得卵母细胞成熟并具备受精能力的技术。作为一种辅助生育的热点前沿技术，尽管其在治疗多囊卵巢综合征(PCOS)、卵巢高/低反应、卵巢反应不齐、供卵、妇女生育力保存等多个领域有广阔的应用前景，然而相关研究统计表明，当前卵母细胞体外成熟培养体系并未完善，表现为成熟率较低，发育潜能差等，目前临床妊娠率仅在20-35％，成为其临床应用的主要瓶颈。因此提高IVM成功率是近年来辅助生殖
研究的关键。在卵母细胞体外成熟研究中，IVM培养液的成分直接影响卵母细胞的成熟率及其后的卵裂与胚胎发育。经过多年的研究，国内外学者逐渐发现在IVM培养液中添加促性腺激素、甾体激素、抗氧化剂、减数分裂抑制剂、生长因子等，使IVM培养系统得到不断优化，改善了培养效果，但是目前提高卵母细胞成熟率和改善卵母细胞发育潜能的效果还不能令人满意。寻找安全、有效的IVM培养液添加成分来促进卵母细胞体外成熟及发育潜能是当前重要的研究方向。卵泡液中一些蛋白或肽含量的变化或修饰的改变能够精确反应卵泡发育成熟的生理过程，因此卵泡液成为研究卵泡发育的独特窗口。然而由于卵泡液中成分复杂，不仅含有理想的促卵母细胞成熟的成分，还含有抑制卵母细胞成熟的物质如卵泡抑素、成熟抑制因子等，不利于研究单因素对卵母细胞体外成熟的影响，因而鉴定卵泡液中促进卵母细胞成熟及改善卵母细胞发育潜能的因子以优化IVM培养体系或许会给我们带来更多惊喜。近年来，小分子多肽在生物体内的功能受到越来越多的重视，它们参与调控人体内各种各样的生理和病理过程，如：多肽通过调控生长素分泌来调节细胞的分泌，通过调控各种信号通路来影响细胞的生长、分化和凋亡等。近年来，小分子多肽在卵母细胞成熟过程中的功能受到生殖研究者的普遍关注，如：ZhangM等发现C型钠肽(CNP)是卵泡内维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键物质，在鼠、牛、山羊、猪等不同哺乳动物卵子体外成熟培养液中加入CNP，能够促进卵子成熟，提高体外受精率及囊胚形成率。由于：①研究发现，细胞自然产生的一些内源性多肽具有分泌极性，能被分泌到体液中参与疾病的发生发展；②卵泡液中一些关键多肽含量的变化能够预测卵母细胞的发育潜能；③小分子多肽具有稳定性强，毒副作用小，特异性高等优点，已广泛应用于临床药物开发，因此从寻找卵泡液中分泌型多肽的角度来挖掘改善IVM培养基的成分给我们提供了新的研究线索。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种分泌型内源性多肽PDFF-CO3。本专利技术的另一目的是提供该分泌型内源性多肽PDFF-CO3的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种分泌型内源性多肽PDFF-CO3，其特征在于氨基酸序列如SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCED(SEQIDNO.1)所示。本专利技术所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3在卵母细胞体外成熟培养中的应用。本专利技术所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3在制备卵母细胞体外成熟培养试剂中的应用。一种卵母细胞体外成熟培养试剂，包含本专利技术所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。作为本专利技术的一种优选,卵母细胞体外成熟培养试剂中本专利技术所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3的浓度为1～2μM,优选1.5μM。一种卵母细胞体外成熟培养方法，使用本专利技术所述的卵母细胞体外成熟培养试剂对卵母细胞进行体外培养或者在卵母细胞体外成熟培养液中添加本专利技术所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。作为本专利技术的一种优选,在卵母细胞体外成熟培养液中能加浓度为1～2μM的所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。作为本专利技术的进一步优选,在卵母细胞体外成熟培养液中能加浓度为1.5μM的所述的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。有益效果：胚胎分泌型内源性多肽PDFF-CO3(SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCED)，为CO3来源肽，由25个氨基酸组成，目前尚无其相关功能报道。生物信息学分析及实验结果显示:①PDFF-CO3来源于CO3蛋白chainA，该区域同样存在于鼠、牛、猪等CO3蛋白上，所以PDFF-CO3的序列在哺乳动物中高度保守。②ProtParam在线分析发现，PDFF-CO3的不稳定系数(Instabilityindex)为37.1，属于稳定型多肽，可稳定存在；脂肪系数(Aliphaticindex)为54.4，平均亲疏水性(Grandaverageofhydropathicity)为-1.256。③FITC标记的PDFF-CO3加入小鼠GV期卵细胞培养液中，14小时后通过激光共聚焦观察发现荧光分布于MII期卵细胞卵周隙及细胞内，表明PDFF-CO3能够穿过胚胎透明带及细胞膜发挥功能。小鼠GV期卵细胞培养液中加入PDFF-CO3，有促进卵细胞成熟的生物学功能；因此，PDFF-CO3可以在制备促进卵细胞成熟及提高卵细胞发育潜能的药物、制备培养液中应用。附图说明图1PDFF-CO3序列在多种动物中高度保守。图2人和小鼠CO3蛋白三维结构具有高度同源性。图3CO3蛋白结构域在多种动物中高度保守。图4FITC标记的PDFF-CO3加入小鼠GV期卵细胞培养液培养14小时后在卵细胞中的定位。图5不同浓度PDFF-CO3对于小鼠GV期卵细胞体外成熟的影响。图6A.不同浓度PDFF-CO3对于小鼠GV期卵细胞生发泡破裂的影响。B.不同浓度PDFF-CO3对于小鼠GV期卵细胞体外成熟的影响。具体实施方式实施例1为了排除个体差异，我们收集5名年轻IVF患者(患者因输卵管因素行IVF治疗，年龄≤30岁，月经规则，基础内分泌、AMH正常)分别收集其成熟卵泡液(成熟组)和窦卵泡液(拮抗剂方案超排卵过程中不同步发育的、需要提前穿刺的卵泡，直径1.0-1.2cm，未成熟组)，利用多肽组学对其进行多肽差异分析。通过质谱鉴定，卵泡液中共计发现多肽519条，其中两组间有显著性差异表达的有311条(差异倍数≥2，T-test，P<0.05)。实施例2①NCBI数据库显示：PDFF-CO3来源于CO3蛋白chainA，(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4I6O_A？report＝genbank&log$＝protalign&blast_rank＝1&RID＝NM01ZJ70014)。该区域同样存在于鼠、牛、猪等CO3蛋白上，所以PDFF-CO3的序列在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于使用包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF-CO3的卵母细胞体外成熟培养试剂对卵母细胞进行体外培养或者在卵母细胞体外成熟培养液中添加氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。/n

【技术特征摘要】
1.一种卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于使用包含氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF-CO3的卵母细胞体外成熟培养试剂对卵母细胞进行体外培养或者在卵母细胞体外成熟培养液中添加氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的分泌型内源性多肽PDFF-CO3。


2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵纯，杨烨，凌秀凤，张军强，曹善仁，张笑兰，于晓宁，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32