用于可激发和不可激发细胞中Ca制造技术

本发明专利技术提供了红移的低亲和力Ca

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于可激发和不可激发细胞中Ca2+成像的低亲和力红色荧光指示剂
本专利技术通常涉及低亲和力的荧光Ca2+指示剂，该指示剂可靶向内质网、肌质网和/或线粒体。
技术介绍
在心脏细胞中，肌质网(SR)负责Ca2+诱导的Ca2+释放(CICR)的放大，这使得电压依赖性Ca2+进入触发肌丝收缩。由于收缩与SR的运动有关，必须采用比率型(ratiometric)(与强度型(intensiometric)相对)的成像方法来校正运动伪影。亚细胞区室(例如线粒体、内质网(ER)和SR)的钙离子(Ca2+)浓度范围跨度为低至微摩尔到高至毫摩尔。在具有高Ca2+浓度的区室中，经优化以用于检测细胞质Ca2+(通常为0.1μM至10μM)的荧光指示剂变得饱和，变得对Ca2+浓度的生理相关变化无反应。为解决此问题，已进行大量的研究工作来开发低亲和力的Ca2+指示剂，包括基因编码的荧光蛋白(FP)。与基于合成染料的指示剂相比，基于FP的指示剂随其相应的DNA编码序列递送至细胞，并且可包括在特定组织中表达或靶向特定亚细胞区室的其他序列。低亲和力指示剂的早期示例包括D1ER和D4cpv，它们基于青色FP和黄色FP之间的Ca2+依赖性荧光共振能量转移(FRET，ResonanceEnergyTransfer)。基于FRET的指示剂本质上是比率型的，可提供不受因细胞器或细胞运动而产生的成像伪影影响的定量测量值。由单个FP工程化的指示剂往往是强度型的，通常会提供更大的信号变化。第一个基于单个FP的靶向ER的低亲和力Ca2+指示剂是CatchERTM。最近，已发现了许多低亲和力GCaMP型Ca2+指示剂，它们由与钙调蛋白(CaM)融合的环状排列(cp，circularlypermutated)FP和与CaM的Ca2+结合形式结合的肽组成。这些指示剂包括CEPIATM、LAR-GECOTM和ER-GCaMPTM系列。另一种发射比率型的低亲和力的基于单个FP的Ca2+指示剂是GEM-CEPIA1erTM，但它需要用高能紫外光(≤400nm)激发，高能紫外光通常与增加的光毒性和自体荧光有关。可能需要使用可用更长波长(即，更多红移或＞400nm)的光激发的指示剂，因为更长波长(即，更多红移或＞400nm)的光通常与降低的光毒性和自体荧光有关。提供此背景信息是出于提供申请人认为可能与本专利技术相关的已知信息的目的。不必然意图为也不应被解释为承认任何前述信息构成了本专利技术的现有技术。
技术实现思路
在一方面，本专利技术可包括一种检测细胞中Ca2+水平变化的方法，该方法包括：(a)获得包含细胞的样品，该细胞经工程化以表达一种以上低亲和力的Ca2+指示剂，该指示剂选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽；(b)使细胞暴露于激发光；以及(c)通过可视化或成像细胞来检测ER、SR和/或线粒体的Ca2+水平的变化。在另一方面，本专利技术可包含选自下组的低亲和力的荧光Ca2+多肽：LAR-GECO1.5，LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，该多肽的氨基酸序列可为SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16或18之一。在一些实施方式中，该多肽可包含选自下组的突变：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。该多肽对Ca2+的Kd可大于20μM，或优选为约60μM。在另一方面，本专利技术可包括编码本专利技术的低亲和力荧光Ca2+多肽的多核苷酸或基本相似的多核苷酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸可包含选自下组的核酸序列：(a)SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15或17；(b)与SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15或17之一具有至少90％序列同一性且编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂对Ca2+的Kd大于20μM或可选地为约60μM，但排除SEQIDNO：1；(c)编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂包含SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列；以及(d)编码荧光Ca2+指示剂的核酸序列，该荧光Ca2+指示剂与SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16或18(但不包括SEQIDNO：2)的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，该荧光Ca2+指示剂大于20μM或可选地为约60μM。在一些实施方式中，多核苷酸包含编码氨基酸突变的突变，该氨基酸突变选自：I54A、I330M和D327N/I330M/D363N。在其他方面，本专利技术可包括载体或宿主细胞，该载体或宿主细胞包含本专利技术的多核苷酸序列。在一些实施方式中，宿主细胞是心肌细胞。附图说明参考附图，附图通过示例而非限制性的方式详细说明了本专利技术的几个方面，其中：图1显示了对低亲和力Ca2+指示剂进行工程化的示意性策略。图2显示了LAR-GECO1、LAR-GECO1.5、LAR-GECO2、LAR-GECO3和LAR-GECO4的氨基酸序列比对。图3显示了LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4的氨基酸序列比对。图4显示了对Ca2+具有宽范围亲和力的强度型和比率型红色Ca2+指示剂。图5显示了LAR-GECO的体外表征。(A、D、G和J)LAR-GECO1.5(A)、LAR-GECO2(D)、LAR-GECO3(G)和LAR-GECO4(J)的激发光谱和发射光谱。(B、E、H和K)在不含Ca2+的状态(虚线)和结合Ca2+的状态(实线)下的LARGECO1.5(B)、LAR-GECO2(E)、LAR-GECO3(H)和LAR-GECO4(K)的吸收光谱和发射光谱。(C、F、I、L)LAR-GECO1.5(C)、LAR-GECO2(F)、LAR-GECO3(I)和LAR-GECO4(L)的荧光强度与pH的关系。图6显示了LAREX-GECO的体外表征。(A、D、G和J)LAREX-GECO1(A)、LAREX-GECO2(D)、LAREX-GECO3(G)和LAREX-GECO4(J)的激发光谱和发射光谱。(B、E、H和K)在不含Ca2+的状态(虚线)和结合Ca2+的状态(实线)下的LAREX-GECO1(B)、LAREX-GECO2(E)、LAREX-GECO3(H)和LAREXGECO4(K)的吸收光谱和发射光谱。(C、F、I和L)LAREX-GECO1(C)、LAREX-GECO2(F)、LAREX-GECO3(I)和LAREX-GECO4(L)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞中Ca

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180302 US 62/637,8081.一种检测细胞中Ca2+水平变化的方法，其中，所述方法包括：
a.获得包含细胞的样品，所述细胞经工程化以表达一种以上低亲和力的Ca2+指示剂，所述指示剂选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽；
b.使细胞暴露于激发光；以及
c.通过可视化或成像细胞来检测ER、SR和/或线粒体的Ca2+水平的变化。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括细胞培养物、干细胞或哺乳动物血浆。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样品包含稳定的永生化细胞系的细胞培养物。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述细胞培养物包括HL1细胞系。


5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是比率型的。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述指示剂是强度型的。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述指示剂与另一种荧光指示剂组合使用。


8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法使用单波长双色成像方法。


9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述另一种荧光指示剂是细胞质钙指示剂。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述指示剂靶向具有细胞器特异性靶向序列的细胞器。


11.一种低亲和力的荧光Ca2+多肽，其中，所述低亲和力的荧光Ca2+多肽选自：LAR-GECO1.5、LAR-GECO2和LAR-GECO3、LAR-GECO4、LAREX-GECO1、LAREX-GECO2、LAREX-GECO3和LAREX-GECO4，或具有与前述任一项基本相似的氨基酸序列的多肽。


12.根据权利要求11所述的多肽，其中，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO：4、6、8、10、12、14、16或18之一。


13.根据权利要求11或12所述的多肽，其中，所述多肽还包含细胞器特异性靶向序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：张郁芬，吴嘉辉，M·J·丹尼尔斯，R·E·坎贝尔，
申请(专利权)人：阿尔伯塔大学理事会，牛津大学校董会，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA