抗新型冠状病毒的IgY中和抗体及其制备方法、制剂和应用技术

本发明专利技术提供了一种利用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S‑ECD蛋白）和刺突蛋白受体结合结构域（RBD）免疫禽类（母鸡）或鸟类（母鸵鸟）制备高效的抗新型冠状病毒特异性IgY中和抗体。本发明专利技术还提供了利用该中和抗体研制的抗新型冠状病毒IgY抗体I型和II型制剂，包括I型‑吸入雾化喷雾剂和输液注射剂以及II型‑外搽剂。本发明专利技术还提供了包含上述抗体和制剂的新型冠状病毒防治药物。本发明专利技术进一步提供了上述抗体和制剂在新型冠状病毒防治药物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
抗新型冠状病毒的IgY中和抗体及其制备方法、制剂和应用
本专利技术涉及应用IgY抗体制备抗病毒制剂，具体涉及一种抗新型冠状病毒IgY中和抗体、制备方法及新冠防御制剂，以及它们的应用。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，或COVID-19）疫情是当今全球最为关注的突发急性传染病事件，已对全球公共卫生界提出了严峻挑战。新型冠状病毒（简称新冠病毒，或SARS-CoV-2）感染人数众多，传播性极强，病死率较高。截止目前为止，尽管在新冠肺炎疫苗研制和治疗手段上有了长足进展，但仍尚无特效药，尚无批准上市的主动免疫疫苗。因此，新冠肺炎疫情控制迫切需要探索防御和诊治的新方法。现今全球范围内，亟需寻求安全高效的特异制剂用于病毒感染的防治。基于病毒感染和产生抗体的基本免疫学机制，同时借鉴既往SARS和MERS防治的经验，被动免疫防治是现阶段应对COVID-19可以采用的优选方案。新型冠状病毒特异性抗体可以中和病毒，起到阻止病毒粘附、入侵宿主细胞的作用，如何研发针对该病毒特异性的中和抗体迫在眉睫。禽类或鸟类IgY抗体具有许多优势。IgY被动免疫治疗策略以前曾用于人类和动物的细菌和病毒感染，其优点主要包括与哺乳动物Fc受体无反应，稳定性好、安全、易于提取和生产。更为重要的是，与哺乳动物IgG相比，IgY具有更高的靶向特异性和更强的结合亲和力,在呼吸道和肺部具有显著的病原体中和活性。IgY抗体生产成本低，且易于提取，来源于鸡蛋黄的天然成分，IgY抗体系无毒安全的免疫制剂。由于IgY抗体系天然产物，不是合成药物，也避免了环境污染。在全球范围内流感期，IgY抗体已测试用于流行性感冒的免疫治疗或预防剂，使用IgY治疗呼吸道感染，多采用鼻喷剂用作快速和安全应对大型流行性感冒的策略。IgY抗体预防性治疗的优越性可能是由于IgY抗体存在呼吸道粘膜表面，起到了吞噬作用，减少病原体增殖。鼻内喷雾制剂方便，适用于卫生保健预防和普通人群家庭预防应用。采用IgY抗体技术研制抗新型冠状病毒中和抗体并制备防护喷雾剂是可行的。在免疫原选择方面，新型冠状病毒刺突蛋白（或S蛋白）是一种跨膜糖蛋白，也是病毒最大的结构蛋白，包含了病毒的主要抗原决定簇，能够刺激机体产生中和抗体和介导免疫反应。新型冠状病毒S蛋白由球状的受体结合亚基S1和棒状的融合亚基S2两部分组成。近N端的S1和近C端的S2是两个独特的功能结构域，决定了冠状病毒的组织嗜性(受体特异性)和膜融合特性(使病毒进入细胞)。研究发现，SARS-CoV-2的S蛋白可以单独完成包膜病毒颗粒的细胞侵入的全过程，其中包括：(1)识别并结合靶细胞受体；(2)病毒与靶细胞融合，将遗传物质释放到胞内。因为S蛋白是病毒识别宿主细胞表面受体血管紧缩素转化酶2(angiotensin-convertingenzyme2,ACE2)的关键分子，表达S蛋白的病毒颗粒可以与表达ACE2的细胞结合并诱导细胞融合。因此，S蛋白在病毒入侵机体时，这一蛋白受体结合结构域（RBD）与宿主细胞受体ACE2之间具有高亲和力，导致新型冠状病毒的跨物种传播和人与人之间的传播。由于S蛋白的胞外区（S-ECD）暴露于病毒表面，含有关键的靶蛋白-RBD，采用S-ECD蛋白将是一个比较理想和有效的免疫抗原，可有效地诱导中和抗体的产生，制备特异性的高效中和抗体，从而直接导致靶蛋白-RBD失活，不能与宿主细胞结合，破坏新型冠状病毒生命周期的每个阶段和阻断了繁殖。
技术实现思路
针对现阶段的迫切需求，本专利技术提供了一种利用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区蛋白（S-ECD蛋白）和刺突蛋白受体结合结构域（RBD）免疫禽类（例如母鸡）或鸟类（例如母鸵鸟）制备抗新型冠状病毒特异性IgY抗体，并研制了抗新型冠状病毒IgY抗体I和II型制剂，经体外病毒中和作用检测，具有明显阻断病毒存活的效果，能够用于新型冠状病毒防治。本专利技术的一个目的是提供一种抗新型冠状病毒的IgY抗体，其特征在于，是利用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S-ECD蛋白）和RBD区免疫禽类或鸟类制备的，在体外对新型冠状病毒有高效中和作用。在另外的具体方案中，所述禽类是母鸡；鸟类是母鸵鸟。在另外的具体方案中，所述抗体在体外对新型冠状病毒的失活率在99%以上。在另外的具体方案中，所述抗体在37℃加速稳定性测试下放置7天或室温下放置至少180天抗体效价和蛋白含量没有明显改变。本专利技术的另一个目的是提供一种抗新型冠状病毒的IgY抗体的制备方法，其特征在于使用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S-ECD蛋白）做免疫抗原与弗氏佐剂按1:1比例混合，制备成乳状液后，皮下多位点注射免疫禽类或鸟类，免疫两次后，第三次及后续用KLH-RBD进行加强免疫；提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，利用S-ECD或RBD包被的板式化学发光ELISA法筛选高特异性抗新型冠状病毒IgY抗体后，制备获得所述IgY抗体。在另外的具体方案中，所述禽类是母鸡；鸟类是母鸵鸟。在另外的具体方案中，所述抗体在体外对新型冠状病毒的失活率在99%以上。在另外的具体方案中，所述抗体在37℃加速稳定性测试下放置7天或室温下放置至少180天抗体效价和蛋白含量没有明显改变。本专利技术的另一个目的是提供一种由上述制备方法制备得到的IgY抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种制剂，包含上述抗新型冠状病毒的IgY抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种抗新型冠状病毒的IgY抗体制剂，其为吸入雾化喷雾剂或输液注射剂，包含上述IgY抗体、氯化钠或甘露醇、和无菌去离子水或注射用水。在另外的具体方案中，其中IgY抗体的含量为10-500mg/mL，所述的氯化钠含量为0.9%或甘露醇含量为10-30g/L。本专利技术的另一个目的是提供一种抗新型冠状病毒的IgY抗体制剂，其为外搽剂，包含上述IgY抗体、保润肤作用的两性离子表面活性剂、消毒灭菌剂和无菌去离子水。在另外的具体方案中，其中IgY抗体的含量为10-500mg/mL；保润肤作用的两性离子表面活性剂为椰油酰胺基丙基甜菜碱，其含量为1％-10％；消毒灭菌剂为双十烷基二甲基氯化铵、六甲基二硅氧烷和十二烷基二甲基苄基溴化铵，且它们的含量分别为0.05-0.3%、0.05-0.3%和0.1-10%。本专利技术的另一个目的是提供本专利技术的上述IgY抗体或IgY抗体制剂在制备新型冠状病毒防治药物中的用途。本专利技术的另一个目的是提供一种新型冠状病毒防治药物，其中含有本专利技术的上述IgY抗体或IgY抗体制剂。本专利技术的特点在于：免疫原—新型冠状病毒刺突蛋白胞外区蛋白（S-ECD蛋白）和刺突蛋白受体结合结构域（RBD）与禽类或鸟类IgY抗体的组合。首先，选用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区蛋白（S-ECD蛋白）作为免疫原，S蛋白的胞外区（S-ECD）暴露于病毒表面，其中包含的S1亚基中的受体结合结构域（RBD）是最关键的目标蛋白。其次，本专利技术以卵黄IgY抗体作为新型冠状病毒防御性中和抗体的开发思路，优点是基于禽类或鸟类的IgY抗体与哺乳动物的IgG抗体比较，有其独特的功能，包括：1）凝集：禽类或鸟类的IgY抗体对外源病原体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗新型冠状病毒的IgY抗体，其特征在于，是利用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S-ECD蛋白）和刺突蛋白受体结合结构域（RBD）免疫禽类或鸟类制备的，在体外对新型冠状病毒有高效中和作用。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗新型冠状病毒的IgY抗体，其特征在于，是利用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S-ECD蛋白）和刺突蛋白受体结合结构域（RBD）免疫禽类或鸟类制备的，在体外对新型冠状病毒有高效中和作用。


2.权利要求1所述的IgY抗体，其中所述禽类是母鸡；鸟类是母鸵鸟。


3.权利要求1-2任一项所述的IgY抗体，其在体外对新型冠状病毒的失活率在99%以上。


4.权利要求1-3任一项所述的IgY抗体，其在37℃加速稳定性测试下放置7天或室温下放置至少180天抗体效价和蛋白含量没有明显改变。


5.一种抗新型冠状病毒的IgY抗体的制备方法，其特征在于使用新型冠状病毒刺突蛋白胞外区（S-ECD蛋白）做免疫抗原与弗氏佐剂按1:1比例混合，制备成乳状液后，皮下多位点注射免疫禽类或鸟类两次后，第三次及后续用KLH-刺突蛋白受体结合结构域（RBD）进行加强免疫；提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，利用S-ECD或RBD包被的板式化学发光ELISA法筛选高特异性抗新型冠状病毒IgY抗体后，制备获得所述IgY抗体。


6.权利要求5所述的制备方法，其中所述禽类是母鸡；鸟类是母鸵鸟。


7.由权利要求5或6所述的制备方法获得的抗新型冠状病毒的IgY抗体。


8.一种制剂，包含权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李劲，张波，李惠军，黑爱莲，方聪，谭俊烨，高鹏，艾伦·何，斯文·斯库格，周际，
申请(专利权)人：华瑞同康生物技术深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44