用于治疗癌症的包含向导RNA和核酸内切酶作活性成分的药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及用于治疗癌症的药物组合物，包含crRNA和核酸内切酶作为活性成分。本发明专利技术可以基于DNA和RNA的特异性结合特性对癌细胞进行特异性治疗来根据患者的需要或细胞类型进行定制。本发明专利技术的CRISPR PLUS系统的核酸酶活性可以通过crRNA与癌细胞中找到的特异性基因之间结合的方式来激活。因此，本发明专利技术的癌症治疗效果比迄今为止已开发的其他抗癌剂更具特异性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗癌症的包含向导RNA和核酸内切酶作活性成分的药物组合物
本公开的实施方式涉及包含向导RNA和核酸内切酶的抗癌组合物。
技术介绍
尽管癌症治疗技术有了重大突破，但是癌症仍然是对人类威胁最大的疾病。癌症可由多种致癌物触发，是一种可由染色体结构或DNA碱基序列变化引起的疾病。癌症最显著的特征之一是持续的细胞增殖。当前，最广泛使用的抗癌疗法是有效杀伤细胞的放射疗法，或者是使用靶向特定癌细胞的化合物或抗体的疗法。但是，包括化学疗法/放射疗法在内的一线疗法可能还会杀伤体内正常的增殖细胞，例如头发和免疫细胞，从而给患者带来严重的副作用和痛苦。因此，需要开发能够选择性地仅杀死体内癌细胞的抗癌剂。为满足这种需求，针对靶向抗癌剂的研究正在积极进行中。靶向抗癌剂是通过控制参与癌症发展中特定的蛋白或通路来治疗癌症的癌症药物。通过将癌细胞的总蛋白水平与正常细胞的总蛋白水平进行比较，可以确定癌细胞特异的靶标。换句话说，特异存在于癌细胞中或癌细胞中富含的蛋白可能是潜在的靶标。靶蛋白的一个例子是人表皮生长因子受体2蛋白(HER-2)。为了治疗过度表达HER-2的乳腺癌和胃癌，几种针对HER-2的靶向治疗剂已被开发，包括曲妥珠单抗(trastuzumab)另一种方法是靶向导致癌症恶化的突变蛋白。例如，分别以修饰形式存在于许多乳腺癌和黑色素瘤中的细胞增殖信号蛋白BRCA1和BRAF。此类突变的许多靶向治疗剂已被开发，并且由此开发的靶向治疗剂已被批准用于治疗无法进行手术或具有转移性癌症的患者。最近的靶向治疗剂和免疫治疗剂是基于在癌细胞中特异性表达的生物标记蛋白研发的。然而，癌细胞中特异性存在的生物标志物蛋白与抗癌剂之间的相互作用强度不是特定的，有时可能会导致副作用。此外，尽管靶向治疗剂和免疫治疗剂的毒性比常规化疗剂低，但仍有许多副作用被报导。因此，在抗癌治疗领域，仍需开发特异性靶向体内癌细胞的抗癌剂。特别地，基于DNA序列差异，即分化癌细胞中的最显著特征开发抗癌剂，是人类长期以来的愿景。专利技术公开内容技术问题癌细胞中存在的染色体结构异常或癌细胞中不同于正常细胞的碱基序列可能是区分癌细胞与正常细胞的重要标准。因此，染色体或碱基序列中的此类差异可能是癌症治疗的重要靶标。因此，实施方式中的一个目的是提供用于治疗癌症的药物组合物，其通过靶向特异性存在于癌细胞中的序列而表现出抗癌作用。技术问题的解决方案为了实现上述目的，一实施方式提供了用于杀伤肿瘤细胞的组合物，该组合物包含与特异性存在于癌细胞中的核酸互补结合的多核苷酸和核酸酶作为活性成分。另外，一实施方式提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含上述组合物。此外，一实施方式提供了用于杀伤肿瘤细胞的组合物，该组合物包含作为活性成分的载体，所述载体包含与特异性存在于癌细胞中的核酸互补结合的多核苷酸以及编码核酸内切酶和核酸外切酶的多核苷酸。进一步，一实施方式提供了治疗癌症的方法，该方法包括将本专利技术的组合物施用于患有癌症的受试者。专利技术的有益效果根据该实施方式的药物组合物是基于DNA和RNA之间单独高特异性的药物，可以针对每个患者和每种癌症进行定制，因为其可以特异性地靶向和杀伤癌细胞。特别地，通过选择性地靶向仅存在于癌细胞中的具有单核苷酸多态性(SNP)和/或拷贝数变异(CNV)的基因，可以有效地仅杀伤患者的癌细胞。另外，由于靶基因在正常细胞中不存在，因此仅癌细胞可以被有效地去除。因此，在安全性方面，该实施方式的制剂优于常规抗癌剂。特别地，当使用含有CRISPR相关蛋白与核酸外切酶，例如RecJ组合的融合蛋白时，可以提供更优异的抗癌剂。附图说明图1是一示意图，其中CRISPR相关蛋白的非特异性核酸外切酶功能被crRNA引导的靶位点结合激活，从而降解癌细胞的靶核酸。图2是一示意图，显示了根据实施例所述的由crRNA、CRISPR相关蛋白和/或核酸外切酶组成的组合物(在下文中，称为CRISPRPLUS系统)在癌细胞中被特异性激活，并起到抗癌剂的作用。图3表明，根据实施例的CRISPR/Cas12a蛋白具有非特异性核酸外切酶活性，这取决于其序列特异性内切酶活性。图4显示了在人癌细胞株HEK293(图4a)和HeLa(图4b)转染CRISPR/Cas12a(Cpf1)核酸酶、crRNA或两个分子结合的RNP复合物，在24、48和72小时后测得的细胞活力。图5显示了特异性结合EGFR突变体和Cas9的向导RNA，在仅脉冲、EGFR_WT和具有EGFR突变体的HCC827细胞株实验组中诱导的细胞凋亡。图6显示的图比较了图5中检测的仅脉冲、EGFR_WT和具有EGFR突变体的HCC827细胞株实验组的活细胞数。图7显示了与靶基因CCR5、HPRT1、MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5和KCNE2互补的向导RNA在肺癌细胞系H1299中诱导的肺癌细胞凋亡。在该实验中，进行脂质转染以导入编码向导RNA和Cas9的核酸。NT1是指不含有与肺癌细胞中的序列互补匹配的序列的向导RNA，用作阴性对照。特别地，证实了与RNAMT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5和KCNE2互补结合的向导RNA可以有效地杀伤肺癌细胞。图8显示了为证实图7所示的凋亡结果而测得的活细胞数。图9显示的图证实肺癌细胞系H1299中与靶基因CCR5、HPRT1、MT2、GNPDA2、SLC15A5和KCNE2互补的向导RNA诱导的肺癌细胞凋亡。包含脂质体的对照组，其中仅进行脂质体转染处理而不导入DNA。图10显示了通过NucBlueLiveReadyProbes试剂和碘化丙啶ReadyProbes试剂获得的NT1对照和GNPDA2实验组的活细胞的显微图像。NucBlueLiveReadyProbes试剂是一种蓝色荧光染料，可对活细胞和死细胞进行染色。碘化丙啶ReadyProbes试剂是一种红色荧光染料，仅染色死细胞。图11显示了检测到的活细胞数，以证实肺癌细胞系H1563中与靶基因CCR5、HPRT1、MT2、IRX1和ADAMTS16互补的向导RNA诱导的肺癌细胞凋亡。图12显示了发光法检测的活细胞数量随时间的变化，以证实肺癌细胞系A549中与靶基因HPRT1、CCR5和MT2互补的向导RNA诱导的肺癌细胞凋亡。图13显示了测定的活细胞数，以证实在肺癌细胞系A549中与靶基因HPRT1、CCR5和MT2互补的向导RNA诱导的肺癌细胞凋亡。图14显示了图13结果的显微镜观察结果。图15显示了发光法检测的活细胞数量随时间的变化，以证实肺癌细胞系A549中与靶基因MT2、CD68、DACH2、HERC2P2和SHBG互补的向导RNA诱导的肺癌细胞凋亡。图16显示了发光法检测的活细胞数量随时间的变化，以证实乳腺癌细胞系SKBR3中与靶基因MT2、ERBB2和KRT16互补的向导RNA诱导的乳腺癌细胞凋亡。图17显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于杀伤肿瘤细胞的组合物，其包含与特异性存在于癌细胞中的核酸互补结合的多核苷酸和核酸酶作为活性成分。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180327 KR 10-2018-00352981.一种用于杀伤肿瘤细胞的组合物，其包含与特异性存在于癌细胞中的核酸互补结合的多核苷酸和核酸酶作为活性成分。


2.如权利要求1所述的组合物，其中所述多核苷酸是crRNA或gRNA。


3.如权利要求1所述的组合物，其中核酸酶是核酸内切酶。


4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸酶是CRISPR相关蛋白。


5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述CRISPR相关蛋白是选自以下的任何一种核酸酶：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、CsMT2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4。


6.如权利要求1所述的组合物，其中癌细胞中特异性存在的核酸的特征在于单核苷酸多态性(SNP)、拷贝数变异(CNV)、结构变异(SV)、基因插入或基因缺失。


7.如权利要求6所述的组合物，其中所述结构变异的特征在于倒位、易位或短核苷酸重复扩增。


8.如权利要求6所述的组合物，其中癌细胞中特异性存在的核酸选自拷贝数变异(CNV)至少为4的基因。


9.如权利要求8所述的组合物，其中癌细胞中特异性存在的核酸选自拷贝数变异(CNV)至少为7的基因。


10.如权利要求1所述的组合物，其中癌细胞中特异性存在的核酸是选自p53、PTEN、APC、MSH2、HBV、HCV和EGFR中的任何一种基因的突变体。


11.如权利要求1所述的组合物，其中还包含核酸外切酶。


12.如权利要求11所述的组合物，其中所述核酸外切酶选自：RecBCD、RecE、RecJ、T5、ExoI、ExoIII、ExoVII、Lexo、TREX2、核糖核酸外切酶T、TREX1、绿豆核酸外切酶，和λ。


13.一种用于杀伤肿瘤细胞的组合物，其包含与癌细胞中特异性存在的核酸互补结合的多核苷酸和含有核酸内切酶和核酸外切酶的融合蛋白作为活性成分。


14.如权利要求13所述的组合物，其中所述内切核酸酶和所述核酸外切酶通过接头连接。


15.如权利要求13所述的组合物，其中所述多核苷酸是crRNA或gRNA。
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔圣和，朴美珍，朴永勋，林正学，金栋煜，印成镕，林钟镇，
申请(专利权)人：GFLAS生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR