核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别涉及核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该核苷酸选自如下核酸序列中的一种：核酸序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的一个序列；或者与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4一致性不低于80％的核酸序列。本发明专利技术启动子优化的RNAi药物具有治疗和预防COL8A2基因Q455K突变引起角膜营养不良的作用。

【技术实现步骤摘要】
核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。
技术介绍
角膜营养不良(Cornealdystrophy，简称CD)是一种遗传性眼科疾病，发病年龄多在20岁以上，患者的角膜组织中的细胞因基因突变使得其功能和结构发生进行性改变，角膜组织异常物质进行性沉积是其病理组织学特征。根据角膜营养不良的角膜累及层次将CD分类为四大类：角膜上皮及上皮下层营养不良、角膜前弹力层营养不良、角膜基质层营养不良和角膜后弹力层及角膜内皮层营养不良。其中角膜内皮细胞营养不良包括FECD(Fuchs角膜内皮细胞营养不良，Fuchsendothelialcornealdystrophy,FECD)、PPCD(后部多形性角膜内皮营养不良，Posteriorpolymorphouscornealdystrophy,PPCD)、CHED(先天性角膜内皮细胞营养不良，Congenitalhereditaryendothelialdystrophy,CHED))、XECD(X连锁性角膜内皮营养不良(X-linkedendothelialcornealdystrophy,XECD))，都是因遗传因素导致角膜内皮细胞功能障碍，其中FECD是最常见的类型。COL8A2基因编码α2多肽胶原Ⅷ型蛋白(α2polypeptideofcollagentypeⅧ)。α2多肽胶原Ⅷ型蛋白由角膜内皮细胞分泌，是后弹力层的重要组成部分。COL8A2基因突变中的Q455K会影响α2多肽胶原Ⅷ型蛋白的三螺旋结构域，导致该蛋白三级结构发生显著改变，致使角膜后弹力层胶原网架分裂，进一步导致FECD。RNA干扰(RNAi)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰RNA(smallinterferenceRNAs,siRNA)诱导产生的一种转录后基因沉默现象。RNAi作用机制可分为2个部分：1)扩增与起始阶段，具有特异序列的dsRNA进入细胞后一方面在RNA依赖的聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp)作用下呈指数级扩增，得到大量针对靶序列的RNA。一方面在Dicer酶的作用下，形成21～23nt的含有2～3nt的3′突出端的siRNA。2)效应阶段，siRNA结合到核糖核苷酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)，该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端，被切割后的断裂mRNA随即降解。在哺乳动物细胞中，RNAi可以由直接导入的siRNA诱导，也可以通过DNA载体如质粒、病毒载体或PCR产物的发夹结构表达shRNA(hairpinRNA)来诱导，对后一种方法而言，由DNA载体介导的RNAi反应能克服siRNA不能在哺乳动物细胞中复制的问题，但是其产生的shRNA数量受不同启动子的影响，进而影响RNAi效率。目前常用的表达shRNA的启动子是RNA聚合酶Ⅲ启动子如U6启动子、H1启动子和tRNA启动子，这些启动子在真核细胞内高效快速转录小片段基因，能避免RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的长颈环样RNA引起的干扰素反应，RNA聚合酶Ⅲ启动子转录小片段基因形成的短颈环结构能在细胞质中被Dicer酶切割产生siRNA，进而诱导RNAi发生。不同启动子对其下游的小片段基因的转录强度不同，产生的siRNA丰度也不同，故筛选高效的启动子对提高RNAi药物的有效性非常重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该启动子优化的RNAi药物具有治疗和预防COL8A2基因Q455K突变引起角膜营养不良的作用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种核苷酸，该核苷酸选自如下核酸序列中的一种：(a)核酸序列为SEQIDNO：3或SEQIDNO：4中的一个序列；(b)与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4一致性不低于80％的核酸序列。作为优选，(b)中核酸序列与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的一致性不低于85％。优选地，(b)中核酸序列与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的一致性不低于90％。更优选地，(b)中核酸序列与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4的一致性不低于95％。本专利技术还提供了一种病毒载体，病毒载体包含上述核苷酸。作为优选，病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。作为优选，病毒载体含有shRNA表达框，以及调控该表达框表达的启动子序列。作为优选，腺相关病毒的血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。本专利技术还提供了上述核苷酸或病毒载体在制备预防或治疗眼部疾病药物中的应用。作为优选，眼部疾病为COL8A2突变引起的福克斯角膜营养不良(Fuchsendothelialcornealdystrophy,FECD)或后部多形性角膜营养不良(posteriorpolymorphousCornealdystrophy,PPCD)。在本专利技术提供的具体实施例中，眼部疾病为COL8A2基因Q455K突变所致疾病。本专利技术还提供了一种RNAi药物制剂，RNAi药物制剂包含上述核苷酸或病毒载体，以及药学上可以接受的载体和赋形剂。作为优选，赋形剂为纳米载体或脂质体。作为优选，RNAi药物制剂为液体制剂。作为优选，RNAi药物制剂的给药方式为前房注射、玻璃体腔注射、结膜下注射或者眼表滴药。本专利技术提供了核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该核苷酸选自如下核酸序列中的一种：核酸序列为SEQIDNO：3或SEQIDNO：4中的一个序列；或者与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4一致性不低于80％的核酸序列。本专利技术的技术效果如下：首先使用分别含有COL8A2野生型和COL8A2基因Q455K突变型靶序列的荧光素酶报告质粒，分别和不同候选启动子表达的shRNA序列质粒进行共转，筛选对Q455K突变位点抑制效率有显著提高的启动子，然后将筛选的启动子表达的AAV-RNAi药物分别对野生型293细胞和COL8A2Q455K突变的293细胞进行处理，检测两种细胞中COL8A2mRNA和蛋白水平的变化，发现筛选后的启动子表达的RNAi药物可以显著降低Q455K突变的COL8A2的mRNA和蛋白的表达，但是对野生型COL8A2的mRNA和蛋白表达没有影响。此外，对不同月龄Q455K突变的COL8A2小鼠使用AAV-RNAi药物处理，发现此药物既可以治疗已经发生的角膜营养不良，也可以预防角膜营养不良的发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸选自如下核酸序列中的一种：/n(a)所述核酸序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的一个序列；/n(b)与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4一致性不低于80％的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸选自如下核酸序列中的一种：
(a)所述核酸序列为SEQIDNO：3或SEQIDNO：4中的一个序列；
(b)与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4一致性不低于80％的核酸序列。


2.一种病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包含权利要求1所述的核苷酸。


3.根据权利要求2所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。


4.根据权利要求2或3所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体含有shRNA表达框，以及调控该表达框表达的启动子序列。


5.根据权利要求3所述的病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，任盛，
申请(专利权)人：武汉纽福斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42