靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。本发明专利技术提供了靶向敲除FRZB基因的双sgRNA，针对FRZB基因第一外显子上两个位点进行切割，后将所述sgRNA构建至表达载体后通过优化的电转体系转染猪成纤维细胞，再利用流式细胞仪分选出高纯度的阳性单克隆细胞，经基因组鉴定筛选得到FRZB敲除的细胞系。本发明专利技术解决了构建敲除细胞系过程中转染效率、打靶效率低、单克隆纯度低的难题，操作简便且得到了较长片段删除的编辑细胞系。涉及到的细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供了较好的研究工具。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。
技术介绍
基因敲除是研究基因功能和遗传改良的有效手段。CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑系统，广泛用于基因功能和转基因动物制备等的研究中。主要原理是通过sgRNA将Cas9蛋白引导至和其序列互补的基因组区域，使得Cas9蛋白和目标基因组序列结合，进行基因组切割导致DNA双链断裂，常通过非同源末端修复的方式，在靶位点处产生一个或几个碱基的插入或缺失，以达到基因功能敲除的目的。然而，由于预测sgRNA效率的方法还不是很完善，1个sgRNA只能靶向基因的1个位点，打靶效率低，即使靶向成功，也可能因为只产生个别几个碱基的indel而不造成移码突变，不影响蛋白的功能。FRZB(Frizzledmotifassociatedwithbonedevelopment)基因编码分泌型卷曲相关蛋白3，是Wnt的天然拮抗剂，可以通过竞争性结合调控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向FRZB基因的双sgRNA，其特征在于，包括FRZB-sgRNA1和FRZB-sgRNA2；/n所述FRZB-sgRNA1的靶向序列为：CAGCACTCAGGCCAACGCCA，/n所述FRZB-sgRNA2的靶向序列为：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC。/n

【技术特征摘要】
1.靶向FRZB基因的双sgRNA，其特征在于，包括FRZB-sgRNA1和FRZB-sgRNA2；
所述FRZB-sgRNA1的靶向序列为：CAGCACTCAGGCCAACGCCA，
所述FRZB-sgRNA2的靶向序列为：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC。


2.根据权利要求1所述的双sgRNA，其特征在于，所述FRZB-sgRNA1的核苷酸序列包括：
FRZB-sgRNA1Oligo1：5'-CACCgTGGCGTTGGCCTGAGTGCTG-3'，
FRZB-sgRNA1Oligo2：5'-AAACCAGCACTCAGGCCAACGCCAC-3'；
所述FRZB-sgRNA2的核苷酸序列包括：
FRZB-sgRNA2Oligo1：5'-CACCgCCAGGCTTTCCGGCCACGAG-3'，
FRZB-sgRNA2Oligo2：5'-AAACCTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC-3'。


3.用于编码权利要求1或2所述双sgRNA的DNA分子。


4.一种生...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博，付玉，张盼，商鹏，张然，张浩，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11