【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用crispr技术沉默内源突变基因及野生型基因，并补充正常蛋白，及其在治疗或缓解视网膜色素变性的应用。
技术介绍
1、视网膜色素变性，即rp(retinitis pigmentosa)，是一种遗传性、进行性、慢性视网膜退行性变，患者最早表现为夜盲，视野逐渐缩小，失去周围视力，严重者最终失明。该病是由于光感受器视杆细胞和视锥细胞或视网膜的视网膜色素上皮细胞异常导致的进行性视力丧失，是视网膜营养不良的一种形式。
2、根据遗传机制，分为显性遗传，隐性遗传，和性连锁性遗传。其中常染色体显性遗传类型约占15％-25％，约20％-30％是由rho(rhodopsin)单基因突变产生蛋白失调使功能异常所致。rho基因编码光敏的g蛋白偶联受体，位于视杆细胞胞外段，参与光信号转导级联过程。rho基因全长6.7kb，有5个外显子，目前已知超过150种突变导致rp。
3、目前，视网膜色素变性缺乏相应的治疗方案且预后不佳。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供了一种基因编辑治疗视网膜色素变性的方案。
2、应用crispr技术可使基因沉默。核酸酶在grna引导下，在目标基因的靶向序列产生双链断裂，随后细胞以nhej修复方式在切口处引入indels，使目标基因产生移码突变或无义突变，导致蛋白异常表达，无法发挥野生型功能，从而达到敲除效果。
3、对这类难以治疗的遗传性疾病，应用基因治疗充满前景。针对常染色体显性遗传rp，利用crispr技术沉默
4、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
5、一方面，本专利技术提供了一种grna，优选地，grna是分别靶向rho基因外显子1、外显子2的引导spcas9的grna，或是分别靶向rho基因外显子1-5的引导sacas9的grna。
6、优选地，所述人grna序列如seq id no:001-seq id no:226所示。
7、另一方面，本专利技术提供了一种病毒载体，其包含一条或多条上述grna序列。
8、另一方面，本专利技术提供了一种密码子优化的人rho基因序列，其编码人光敏的g蛋白偶联受体(rho蛋白，如seq id no:233所示)的rho基因。
9、优选地，所述人rho基因序列如seq id no:227-seq id no:231所示。
10、另一方面，本专利技术提供了一种第一病毒载体，其包含编码sacas9或spcas9的基因序列。
11、优选地，所述载体为慢病毒载体或者腺相关病毒载体。
12、更优选地，所述载体为腺相关病毒载体。所述腺相关病毒载体载体的血清型为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15或aav16。
13、在本专利技术的一些具体实施例中，所述载体还包括了启动子序列和polya。
14、优选地，所述载体还包含了kozak序列。
15、可选地，所述第一病毒载体包含所述grna序列。优选地，所述载体包含上述一条或者多条grna。更优选地，所述病毒载体包含上述一条或者两条grna。
16、另一方面，本专利技术提供了一种第二病毒载体，其包含上述密码子优化的rho基因。
17、优选地，所述载体为慢病毒载体或者腺相关病毒载体。
18、更优选地，所述载体为腺相关病毒载体。所述腺相关病毒载体载体的血清型为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15或aav16。
19、在本专利技术的一些具体实施例中，所述载体还包括了启动子序列和polya。
20、优选地，所述载体还包含了kozak序列。
21、可选地，所述第一病毒载体包含所述grna序列。优选地，所述载体包含上述一条或者多条grna。更优选地，所述病毒载体包含上述一条或者两条grna。
22、另一方面，本专利技术提供了一种载体组合物，其包含本专利技术的第一病毒载体或第二病毒载体，其中一个病毒载体包含上述的grna序列。优选地，所述载体包含上述一条或者多条grna。
23、更优选地，所述病毒载体包含上述一条或者两条grna。
24、在一些具体实施方式中，包含编码sacas9或spcas9的基因序列的第一病毒载体含有上述grna序列，而包含编码人光敏的g蛋白偶联受体的rho基因的第二载体不包含上述grna序列。
25、在一些具体的实施方式中，包含编码人光敏的g蛋白偶联受体的rho基因的第二载体含有上述grna序列，而包含编码sacas9或spcas9的基因序列的第一载体不包含上述grna序列。
26、另一方面，本专利技术还提供了前述第一病毒载体和第二病毒载体在制备预防和/或治疗视网膜色素变性的药物中的应用。
27、另一方面，本专利技术还提供了一种药物制剂，其包含上述第一病毒载体和第二病毒载体。
28、优选地，所述药物制剂包括药学上可接受的辅料，包括药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。
29、优选地，所述药物制剂为液体制剂。
30、更优选地，所述液体制剂注射至病人眼部。
31、本专利技术还提供了前述第一病毒载体和第二病毒载体、药物制剂在治疗视网膜色素变性中的应用。
32、本专利技术还提供了一种药物的递送方法，将上述药物施用于哺乳动物或人的眼部。
33、优选地，施用于眼部的给药方式为视网膜下注射。
34、本专利技术还提供了一种治疗视网膜色素变性的方法，其包括向有需要的患者施用包含所述第一病毒载体和第二病毒载体的药物制剂。优选地，将所述药物施用于哺乳动物或人的眼部。更优选地，施用于眼部的给药方式为视网膜下注射。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种gRNA，其具有结合RHO基因的靶序列的靶向结构域，并具有如SEQ ID NO:001-SEQ ID NO:226所示的序列。
2.一种病毒载体，其包含一条或多条权利要求1所述的gRNA，包含1条或2条。
3.一种核苷酸，具有如SEQ ID NO:227-SEQ ID NO:231所示的序列，编码人光敏的G蛋白偶联受体(RHO蛋白)。
4.一种病毒载体，其包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
5.一种载体组合物，其特征在于，其包含第一病毒载体和第二病毒载体，所述第一病毒载体包含编码SaCas9或SpCas9的基因序列，所述第二病毒载体包含密码子优化的RHO基因，密码子优化的RHO基因的核苷酸序列如权利要求3所述。
6.如权利要求5所述的载体组合物，其特征在于，第一病毒载体和第二病毒载体中的一个病毒载体包含如权利要求1所述的gRNA序列。
7.如权利要求5-6任一项所述的载体组合物，其特征在于，第一病毒载体或第二病毒载体中包含如权利要求1所述的一条或者多条gRNA。
8.如权利要求5-6任一项
9.一种药物制剂，其包含如权利要求5-8任一项所述的病毒载体组合物。
10.如权利要求1所述的gRNA、如权利要求2或4所述的病毒载体、如权利要求3所述的核苷酸、如权利要求5-8任一项所述的病毒载体组合物在制备治疗视网膜色素变性药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种grna，其具有结合rho基因的靶序列的靶向结构域，并具有如seq id no:001-seq id no:226所示的序列。
2.一种病毒载体，其包含一条或多条权利要求1所述的grna，包含1条或2条。
3.一种核苷酸，具有如seq id no:227-seq id no:231所示的序列，编码人光敏的g蛋白偶联受体(rho蛋白)。
4.一种病毒载体，其包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
5.一种载体组合物，其特征在于，其包含第一病毒载体和第二病毒载体，所述第一病毒载体包含编码sacas9或spcas9的基因序列，所述第二病毒载体包含密码子优化的rho基因，密码子优化的rho基因的核苷酸序列如权利要求3所述。
...【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，李秋棠，陈超，张珊珊，
申请(专利权)人：武汉纽福斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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