一种人胚胎干细胞培养基及其制备方法技术

本发明专利技术属于干细胞培养基领域，具体涉及一种人胚胎干细胞培养基及其制备方法。本发明专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，包括如下组分及其重量百分数：BRL‑3A条件培养基95.6～97.7％，尤加利精油0.2～0.4％，甘草根提取物0.3～0.5％，虎杖提取物0.2～0.4％，I型胶原1～2％，非必需氨基酸0.1～0.3％，碱性成纤维细胞生长因子0.5～0.8％。本发明专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，在大量培养人胚胎干细胞的同时，还能维持良好的细胞干性，且不易引起外来各种细菌的感染。

【技术实现步骤摘要】
一种人胚胎干细胞培养基及其制备方法
本专利技术属于干细胞培养基领域，具体涉及一种人胚胎干细胞培养基及其制备方法。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞。)胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。自1981年Evans和Kaufman首次成功分离小鼠ES细胞，国内外研究人员已在仓鼠、大鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲长尾猴以及人类都分离获得了ES细胞，而且已经证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体，更重要的是，ES细胞将会给人类移植医学带来一场革命。进一步说，胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞(EC细胞)的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如:德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。然而，在人胚胎干细胞培养领域，一直存在成本高，体外培养不稳定，容易被杂菌污染等问题。中国专利CN100465268C公开了一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基；所述培养基中包含小牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、谷氨酰胺等成分，采用该培养基培养的细胞具有增殖快、凋亡率低、安全稳定、传代时间长等优点，然而，该培养基中添加了动物血清，容易使培养基受多种细菌污染，影响细胞培养效率。综上所述，现有技术中人胚胎干细胞的培养普遍存在体外培养细胞不稳定，成本高，容易被杂菌污染等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术普遍存在的缺点，提供了一种人胚胎干细胞培养基及其制备方法。本专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，向BRL-3A条件培养基中加入一些辅助成分，以达到降低成本，维持良好的细胞干性，且不易引起外来各种细菌的感染的优点。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种人胚胎干细胞培养基，包括如下组分及其重量百分数：BRL-3A条件培养基95.6～97.7％，尤加利精油0.2～0.4％，甘草根提取物0.3～0.5％，虎杖提取物0.2～0.4％，I型胶原1～2％，非必需氨基酸0.1～0.3％，碱性成纤维细胞生长因子0.5～0.8％。优选地，所述的人胚胎干细胞培养基，由如下组分及其重量百分数组成：BRL-3A条件培养基96.6％，尤加利精油0.3％，甘草根提取物0.4％，虎杖提取物0.3％，I型胶原1.5％，非必需氨基酸0.2％，碱性成纤维细胞生长因子0.7％。优选地，所述甘草根提取物的制备方法为：取甘草块根，干燥，粉碎，过200目筛，置于三倍体积的体积分数为75％的乙醇溶剂中提取2h，将提取液减压浓缩，然后纯化水洗涤2次，洗涤后的提取液再次进行减压浓缩，然后干燥，即得。优选地，所述虎杖提取物的制备方法为：取虎杖饮片，粉碎，过100目筛，用3倍体积的体积分数为85％的乙醇于80℃下回流提取2次，每次2h，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，用乙酸乙酯萃取，减压回收得二苯乙烯类；将水层酸水解后经乙醚采用索氏法提取至无色，醚层经质量分数为5％的氢氧化钠溶液萃取，酸化后得到蒽醌类；将二苯乙烯类与蒽醌类混合，即得。优选地，所述非必需氨基酸由丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸按质量比3～5：1～2：7～8：5～7组成。本专利技术还提供了一种所述人胚胎干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：S1、将BRL-3A条件培养基加热至40～45℃，然后向其中加入甘草根提取物及虎杖提取物，混合均匀，得混合物I；S2、保持40～45℃的温度，向步骤S1所得混合物I中加入尤加利精油，混合搅拌均匀，得混合物II；S3、将步骤S2所得混合物II降温至20～25℃，加入I型胶原，非必需氨基酸，碱性成纤维细胞生长因子，混合均匀，即得。优选地，步骤S1所述混合均匀的条件为于200～300rpm的转速下，搅拌10～15min。优选地，步骤S2所述混合搅拌均匀的条件为于300～400rpm的转速下，搅拌20～25min。优选地，步骤S3所述混合均匀的条件为于250～350rpm的转速下搅拌30～40min。本专利技术中，以BRL-3A条件培养基作为培养人胚胎干细胞的基础培养基，并进一步向培养基中加入尤加利精油及甘草根提取物，二者混合使用，可以达到良好的杀菌效果，防止细胞培养过程中各种杂菌的生成；加入自制的虎杖提取物，可以为细胞增殖提供营养物质，提高细胞增殖能力。此外，专利技术人还意外发现，将甘草根提取物与尤加利精油混合使用，虽然可以增加抗菌性能，但容易导致培养过程中细胞干性下降，而向培养基中，加入少量的虎杖提取物，可以克服该缺点，维持人胚胎干细胞的干性，在促进细胞增殖的同时，不会破坏细胞干性，保持分化成其他组织、器官的全能性。而且，本专利技术在培养人胚胎干细胞过程中，加入了由丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸按质量比3～5：1～2：7～8：5～7组成的非必需氨基酸，而不是加入所有的非必需氨基酸，可以更好的维持细胞全能性。与现有技术相比，本专利技术提供的人胚胎干细胞培养基具有如下优点：(1)本专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，加入尤加利精油及甘草根提取物，杀菌效果显著，防止细胞培养过程中各种杂菌的生成；(2)本专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，加入少量的虎杖提取物及按一定比例组成的非必需氨基酸，可以提高细胞增殖能力，维持良好的细胞干性，保持细胞分化成其他组织、器官的全能性；(3)本专利技术提供的人胚胎干细胞培养基，添加的成分简单，且培养基制备方法简单，极大地降低了生产成本，适用于人胚胎干细胞的大规模培养。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本专利技术，而不能用来限制本专利技术，所有与本专利技术相同或相近的技术方案均在本专利技术的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。所述BRL-3A条件培养基可购自上海钰博生物科技有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胚胎干细胞培养基，其特征在于，包括如下组分及其重量百分数：BRL-3A条件培养基95.6～97.7％，尤加利精油0.2～0.4％，甘草根提取物0.3～0.5％，虎杖提取物0.2～0.4％，I型胶原1～2％，非必需氨基酸0.1～0.3％，碱性成纤维细胞生长因子0.5～0.8％。/n

【技术特征摘要】
1.一种人胚胎干细胞培养基，其特征在于，包括如下组分及其重量百分数：BRL-3A条件培养基95.6～97.7％，尤加利精油0.2～0.4％，甘草根提取物0.3～0.5％，虎杖提取物0.2～0.4％，I型胶原1～2％，非必需氨基酸0.1～0.3％，碱性成纤维细胞生长因子0.5～0.8％。


2.如权利要求1所述的人胚胎干细胞培养基，其特征在于，由如下组分及其重量百分数组成：BRL-3A条件培养基96.6％，尤加利精油0.3％，甘草根提取物0.4％，虎杖提取物0.3％，I型胶原1.5％，非必需氨基酸0.2％，碱性成纤维细胞生长因子0.7％。


3.如权利要求1或2所述的人胚胎干细胞培养基，其特征在于，所述甘草根提取物的制备方法为：取甘草块根，干燥，粉碎，过200目筛，置于三倍体积的体积分数为75％的乙醇溶剂中提取2h，将提取液减压浓缩，然后纯化水洗涤2次，洗涤后的提取液再次进行减压浓缩，然后干燥，即得。


4.如权利要求1或2所述的人胚胎干细胞培养基，其特征在于，所述虎杖提取物的制备方法为：取虎杖饮片，粉碎，过100目筛，用3倍体积的体积分数为85％的乙醇于80℃下回流提取2次，每次2h，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，用乙酸乙酯萃取，减压回收得二苯乙烯类；将水层酸水解后经乙醚采用索氏法提取至无色，醚层经质量分数为5％的氢氧化钠溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张印，
申请(专利权)人：广州同康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44