骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法技术

本发明专利技术属于培养基技术领域，具体涉及一种骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法。本发明专利技术骨骼肌干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.1‑0.5μg/mL，L‑谷氨酰胺3‑7μg/mL，生长促进剂6‑12ng/mL，载体0.2‑0.5μg/mL，亚硒酸钠20‑30ng/mL，烟酰胺0.7‑1.2μg/mL，L‑谷胱甘肽2‑5μg/mL，纤粘连蛋白1‑3μg/mL。本发明专利技术骨骼肌干细胞无血清培养基排除了动物来源的病原体污染，所含成分明确，重现性、可控性明显优于血清培养基，可保证培养基批次间的一致性，且安全性高，且能够大大增强骨骼肌干细胞的增殖能力。

【技术实现步骤摘要】
骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法
本专利技术属于培养基
，具体涉及一种骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
种子细胞是组织工程研究中最基本，也是首要的环节。来源于中胚层的间充质干细胞是种子细胞研究的热点之一，它易于分离、培养及大量扩增并且具有多向分化潜能。其中研究较多的是骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞，在一定条件下它们可以向骨、软骨、脂肪等组织分化。由Mauro首次发现的骨骼肌干细胞同样是来源于中胚层的间充质干细胞-胚胎血管祖细胞，位于肌纤维的肌膜和基底膜之间，处于DNA合成的静止期，不进入细胞周期。骨骼肌干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下能发生表型的转化，可分化为成肌细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等。已经证明骨形态发生蛋白能促进骨骼肌干细胞增殖和成骨分化。骨骼肌干细胞取自肌肉组织，其来源丰富、取材方便、对机体损伤小，有较强的增殖传代能力，又因取自自体组织，回植时不存在免疫排斥反应，在一定的诱导条件下有较强的成骨分化活性，因此它就有可能成为骨组织工程一种新的种子细胞。骨骼肌干细胞也称骨骼肌卫星细胞，主要存在于肌纤维的肌膜层与基底膜之间，具有自我更新、多向分化的能力，在骨骼肌的损伤修复中起着重要的作用，并在心肌等疾病的自身修复中显示了良好的临床应用前景。血清是一种成分复杂的混合物，由血浆去除纤维蛋白后形成的。它含有各种生长因子、血浆蛋白、多肽、维生素、微量元素及激素等大量的细胞生长与增殖所必需的成分。虽然含血清的培养基可满足大部分细胞培养的要求，但血清的使用在细胞的大规模培养与疫苗、抗体产业化生产中存在诸多不利因素。血清成分复杂，部分组分尚不明确，且血清含量与组分随供血动物的年龄、性别、营养条件和生理条件不同而存在差异。此外，价格昂贵、易被支原体及病毒污染、血清中大量成分不明的蛋白质不利于生物制品的下游分离纯化等问题使血清在细胞体外培养中备受争议。目前，现有的骨骼肌干细胞无血清培养基大多含有血清，存在动物来源的病原体污染，如果使用含有动物血清的培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突，这会降低骨骼肌干细胞在应用上的安全性。而且现有的骨骼肌干细胞无血清培养基还存在细胞增殖的速度慢等问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法。本专利技术提供的骨骼肌干细胞无血清培养基排除了动物来源的病原体污染，所含成分明确，重现性、可控性明显优于血清培养基，可保证培养基批次间的一致性，且安全性高，且能够大大增强骨骼肌干细胞的增殖能力。本专利技术的技术方案是：一种骨骼肌干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.1-0.5μg/mL，L-谷氨酰胺3-7μg/mL，生长促进剂6-12ng/mL，载体0.2-0.5μg/mL，亚硒酸钠20-30ng/mL，烟酰胺0.7-1.2μg/mL，L-谷胱甘肽2-5μg/mL，纤粘连蛋白1-3μg/mL。进一步地，所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.3μg/mL，L-谷氨酰胺6μg/mL，生长促进剂10ng/mL，载体0.4μg/mL，亚硒酸钠25ng/mL，烟酰胺0.9μg/mL，L-谷胱甘肽3μg/mL，纤粘连蛋白2μg/mL。进一步地，所述基础培养基为F12培养基或DMEM培养基。进一步地，所述生长促进剂由栀子苷、酪氨酸和硫酸锌按质量比1-2:5-7:12-15组成。进一步地，所述生长促进剂由栀子苷、酪氨酸和硫酸锌按质量比1:6:14组成。进一步地，所述载体由酪蛋白磷酸肽和聚乙二醇按质量比7-10:1-3组成。进一步地，所述载体由酪蛋白磷酸肽和聚乙二醇按质量比8:3组成。进一步地，所述聚乙二醇的平均分子量为300。另外，本专利技术还提供了骨骼肌干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向基础培养基中加入胰高血糖素、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、烟酰胺和L-谷胱甘肽，搅拌，搅拌速度为100-150r/min，搅拌时间为10-15min，加入生长促进剂、纤粘连蛋白和载体，继续搅拌20-30min，调节pH至6.8-7.2，用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。本专利技术中，由栀子苷、酪氨酸和硫酸锌按一定质量比组成的生长促进剂中，栀子苷、酪氨酸和硫酸锌联合应用能够协同增效，不仅可以起到刺激细胞生长的作用，提高对体外培养的骨骼肌干细胞的增殖与分化作用，还可以起到防止细胞损伤的作用，提高细胞活性。本专利技术中，添加的由酪蛋白磷酸肽和聚乙二醇组成的载体，不仅可以起到促进骨骼肌干细胞无血清培养基中的组分更好的被骨骼肌干细胞吸收的作用，进而促进细胞的增殖速度，还可以起到增强骨骼肌干细胞在骨骼肌干细胞无血清培养基中的粘附能力，促进骨骼肌干细胞在无血清培养体系下的贴壁生长。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)本专利技术提供的骨骼肌干细胞无血清培养基排除了动物来源的病原体污染，所含成分明确，重现性、可控性明显优于血清培养基，可保证培养基批次间的一致性，且安全性高。(2)本专利技术提供的骨骼肌干细胞无血清培养基能够显著提高骨骼肌干细胞的扩增速度，大大增强骨骼肌干细胞的增殖能力，且细胞活性高。具体实施方式下面对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术中所用原料如无特殊说明，均为市售。如F12培养基可购自上海联硕生物科技有限公司，货号：SH30026.01B；DMEM培养基可购自上海联硕生物科技有限公司，货号：11965-092；纤粘连蛋白可购自北京百奥莱博科技有限公司，型号：Y13261；酪蛋白磷酸肽可购自北京百奥莱博科技有限公司，型号：Y15011；栀子苷可购自上海甄准生物科技有限公司，型号：ES-0206。实施例1、一种骨骼肌干细胞无血清培养基所述骨骼肌干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.1μg/mL，L-谷氨酰胺3μg/mL，生长促进剂6ng/mL，载体0.2μg/mL，亚硒酸钠20ng/mL，烟酰胺0.7μg/mL，L-谷胱甘肽2μg/mL，纤粘连蛋白1μg/mL；所述基础培养基为F12培养基；所述生长促进剂由栀子苷、酪氨酸和硫酸锌按质量比1:7:15组成；所述载体由酪蛋白磷酸肽和平均分子量为300的聚乙二醇按质量比7:3组成。所述骨骼肌干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向基础培养基中加入胰高血糖素、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、烟酰胺和L-谷胱甘肽，搅拌，搅拌速度为100r/min，搅拌时间为10min，加入生长促进剂、纤粘连蛋白和载体，继续搅拌20min，调节pH至6.8，用0.22μm滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.1-0.5μg/mL，L-谷氨酰胺3-7μg/mL，生长促进剂6-12ng/mL，载体0.2-0.5μg/mL，亚硒酸钠20-30ng/mL，烟酰胺0.7-1.2μg/mL，L-谷胱甘肽2-5μg/mL，纤粘连蛋白1-3μg/mL。/n

【技术特征摘要】
1.一种骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.1-0.5μg/mL，L-谷氨酰胺3-7μg/mL，生长促进剂6-12ng/mL，载体0.2-0.5μg/mL，亚硒酸钠20-30ng/mL，烟酰胺0.7-1.2μg/mL，L-谷胱甘肽2-5μg/mL，纤粘连蛋白1-3μg/mL。


2.如权利要求1所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：胰高血糖素0.3μg/mL，L-谷氨酰胺6μg/mL，生长促进剂10ng/mL，载体0.4μg/mL，亚硒酸钠25ng/mL，烟酰胺0.9μg/mL，L-谷胱甘肽3μg/mL，纤粘连蛋白2μg/mL。


3.如权利要求1或2所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为F12培养基或DMEM培养基。


4.如权利要求1或2所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述生长促进剂由栀子苷、酪氨酸和硫酸锌按质量比1-2:...

【专利技术属性】
技术研发人员：张印，
申请(专利权)人：广州同康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44