间充质干细胞的驯化培养方法技术

本发明专利技术涉及间充质干细胞的驯化培养方法。具体涉及无血清驯化培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采集脐带，剥取华通氏胶，加入完全培养基，于培养箱中静置培养，去除组织块并全量更换完全培养基继续进行培养，得到的细胞接下来进行消化；加胰蛋白酶溶液消化，加入完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，得到P0代细胞；将P0代细胞沉淀用含小于10%血清的驯化培养基重悬，于培养箱中静置培养，添加胰蛋白酶溶液消化，中和，得到P1代细胞；接着用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；任选的，继续用无血清驯化培养基进行培养、传代，本发明专利技术方法呈现说明书所述优良效果。

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞的驯化培养方法
本专利技术属于生物技术和生物医药领域，涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地涉及一种无血清体外驯化培养人间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999;284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：/n(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管；/n(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm

【技术特征摘要】
1.无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管；
(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL；
(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化；
(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞；
(5)将P0代细胞沉淀用含小于10%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃5%CO2培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的MSC驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞；
(6)采用步骤(5)培养和消化的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的MSC驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代；
其中，
所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白8~12ng/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，许晓椿，刘庆喜，
申请(专利权)人：英科博雅基因科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12