间充质干细胞的驯化培养方法技术

本发明专利技术涉及间充质干细胞的驯化培养方法。具体涉及无血清驯化培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采集脐带，剥取华通氏胶，加入完全培养基，于培养箱中静置培养，去除组织块并全量更换完全培养基继续进行培养，得到的细胞接下来进行消化；加胰蛋白酶溶液消化，加入完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，得到P0代细胞；将P0代细胞沉淀用含小于10%血清的驯化培养基重悬，于培养箱中静置培养，添加胰蛋白酶溶液消化，中和，得到P1代细胞；接着用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；任选的，继续用无血清驯化培养基进行培养、传代，本发明专利技术方法呈现说明书所述优良效果。

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞的驯化培养方法
本专利技术属于生物技术和生物医药领域，涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地涉及一种无血清体外驯化培养人间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999;284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库已有诸多文献报道，例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的专利技术；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的专利技术；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的专利技术。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。间充质干细胞的体外培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行培养传代时，所用的培养基都需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10%胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)对间充质干细胞进行培养传代。然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清驯化培养间充质干细胞是有意义的。CN108642002A(201810047983.2)公开了一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法。该方法使用新鲜的无血清基础培养基，按照一定的比例添加并置换体外人间充质干细胞的有血清完全培养液，利用间充质干细胞自身在培养过程中分泌的外泌体和微囊成分作为补充，使间充质干细胞完成无血清培养的驯化，最终实现无血清培养体系。据信该专利技术驯化后的间充质干细胞的密度及活率、细胞表面的主要标志物与有血清培养基无明显差异，检测培养液及外泌体所分泌的细胞因子的组分和丰度发现，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升。然而，由于该CN108642002A方法是细胞直接用无血清的培养基进行培养，细胞环境营养急剧降低，会对细胞产生诸多不利的影响。因此，本领域仍然期待提供一种新的方法来培养间充质干细胞，尤其是提供一种新的方法进行无血清体外驯化培养人间充质干细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种独特的培养方法，为人间充质干细胞的体外培养提供一种无血清驯化培养的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。本专利技术的第一方面，提供了一种无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管。(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL。(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化。(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞。(5)将P0代细胞沉淀用含小于10%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃5%CO2培养箱中静置培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：/n(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管；/n(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm

【技术特征摘要】
1.无血清驯化培养间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用组织清洗液清洗胎盘表面以去除表面淤血，剪取脐带并去除内部血管；
(2)剥取脐带中的华通氏胶，清洗，剪成2~3mm3的小块，转移至T75培养瓶中，每瓶1mL；
(3)向培养瓶中缓慢加入MSC完全培养基10mL，轻轻晃动培养瓶，使脐带组织块平铺于培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中静置培养，每间隔2-3天补液一次，共补液2-3次后，去除组织块并全量更换MSC完全培养基继续进行培养直至细胞生长至融合度达70%时，得到的细胞接下来进行消化；
(4)将培养瓶中的培养基吸弃，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL的MSC完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P0代次的细胞；
(5)将P0代细胞沉淀用含小于10%胎牛血清的MSC驯化培养基10mL重悬，进行细胞计数，然后按照接种密度1×104个MSC细胞/cm2接种至T75培养瓶中，补充上述MSC驯化培养基至10mL，37℃5%CO2培养箱中静置培养72h以上，直至细胞融合度达80%，吸弃培养瓶中的培养基，吸取PBS润洗培养瓶以去除残留的胎牛血清，添加3mL的0.25%胰蛋白酶溶液消化，轻拍培养瓶使细胞脱落至培养瓶底部，加入10mL本步骤使用的MSC驯化培养基将胰蛋白酶中和以终止消化过程，用移液器吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，离心、弃上清液，得到细胞沉淀记为P1代细胞；
(6)采用步骤(5)培养和消化的方法，对操作过程中的上一步骤所得细胞用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的MSC驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；
(7)将上一步骤所得无血清驯化培养的最后代次间充质干细胞继续用含有0%胎牛血清MSC驯化培养基进行培养、传代；
其中，
所述MSC驯化培养基中包含：转铁蛋白8~12ng/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，许晓椿，刘庆喜，
申请(专利权)人：英科博雅基因科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12