一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺制造技术

本发明专利技术提供一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，包括包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5%巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4%聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶，该培养工艺利用三维培养的水凝胶载体以提供细胞生长的支撑，在较少的培养基体积内生产更多的骨髓间充质干细胞，降低无血清培养基的消耗和培养空间以实现大规模的细胞生产应用于后续细胞治疗产品的产业化。

A culture technology of human bone marrow mesenchymal stem cells using three-dimensional cells

【技术实现步骤摘要】
一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺
本专利技术是一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，属于细胞培养

技术介绍
因为动物血清来源自动物体内，其生物复杂性和不确定性及批次间的差异增加了细胞制品生产及质量控制的难度，同时血清容易引起细菌、真菌、病毒及支原体的污染，增加生物制品生产的安全性隐患。并且动物血清本身价格也比较安规，这些都使得动物血清在生产和研究中的应用存在诸多不利。在培养基中添加血清对人们所造成的这些困扰，已经使得不论是科研人员还是工业生产企业对于无血清培养基产生了强烈需求。有大量实践证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷，而且也能取得良好的培养效果。同时以干细胞和免疫细胞为主的细胞治疗产品生产过程中，应用无血清培养体系可以杜绝大多数外源微生物的污染，符合干细胞治疗药物上市申报的质量要求。因此，无血清培养体系是骨髓间充质干细胞体外培养工艺的必然方向。无血清培养基是在合成培养基的基础上发展起来，旨在寻求血清的替代成分，使其既能满足细胞培养的要求又能避免血清所带来不利影响。从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5%巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4%聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶；/n所述人骨髓间充质干细胞为从成人捐献的骨髓液中分离并连续传代培养获得的间充质干细胞，在细胞的培养过程中全部采用无外源动物成分的无血清培养体系进行培养，该培养工艺以传统的二维细胞培养获得足够的骨髓间充质干细胞后，待三维细胞培养载体充分混匀但仍为液体状态是与细胞悬液经过充分混匀完成细胞接种，后续的培养过程中，该接种细...

【技术特征摘要】
1.一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：包括三维细胞培养载体和人骨髓间充质干细胞，所述三维细胞培养载体配方是1.5%巯基化透明质酸溶于DMEM低糖基础培养基和4%聚乙二醇二丙烯酸酯溶于DMEM低糖基础培养基，两种溶液互相混匀后于室温形成的原位交联透明质酸水凝胶；
所述人骨髓间充质干细胞为从成人捐献的骨髓液中分离并连续传代培养获得的间充质干细胞，在细胞的培养过程中全部采用无外源动物成分的无血清培养体系进行培养，该培养工艺以传统的二维细胞培养获得足够的骨髓间充质干细胞后，待三维细胞培养载体充分混匀但仍为液体状态是与细胞悬液经过充分混匀完成细胞接种，后续的培养过程中，该接种细胞的透明质酸水凝胶充分浸没于无血清完全培养体系中，进行细胞扩增培养，最终经透明质酸酶酶解水凝胶回收细胞，从而实现人骨髓间充质干细胞的体外三维立体培养扩增细胞。


2.根据权利要求1所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：原代骨髓间充质干细胞的分离；
步骤二：骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获；
步骤三：透明质酸水凝胶的原位交联；
步骤四：P3代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P4代培养扩增；
步骤五：消化收获P4代骨髓间充质干细胞接种到透明质酸水凝胶中做三维细胞P5代培养扩增；
步骤六：消化收获P5代骨髓间充质干细胞冻存作为产品。


3.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述原代骨髓间充质干细胞的分离包括以下步骤：
（1）在无菌条件下新鲜采集的骨髓液按照每5ml可以接种1个T150细胞培养瓶的体积分装至离心管中加入等体积的PBS缓冲液稀释；
（2）稀释后的骨髓液缓慢添加到Ficoll人外周血淋巴细胞分离液上层，Ficoll的体积与稀释后的骨髓液体积比为1:1；
（3）进行密度梯度离心，离心条件为300g，20min，20℃，离心加速度和减速度设置为离心机允许的最小值；
（4）离心完成后弃去上层清液吸取中间白膜层细胞，回收的细胞悬液使用4倍体积的无血清培养基洗涤混匀后离心，离心条件为1100rpm，5min，室温；
（5）离心后倾倒弃去全部上清液，按照每5ml骨髓液回收的细胞接种1个T150培养瓶的比例加入24ml无血清培养基重悬后接种于T150培养瓶内；
（6）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（7）原代骨髓间充质干细胞的分离中所用的溶液均为无外源微生物污染的商品化溶液，操作过程中严格遵循无菌操作技术；
（8）骨髓液的供者在采集骨髓前已经确认为无传染病风险成年人，包括但不限于以下传染病：乙肝、丙肝、梅毒、HIV，其骨髓组织采集的过程中无细菌，真菌，支原体污染；
（9）本操作中所提及的无血清培养基及无血清培养体积均基于GIBCOCTS™StemPro™MSCSFM人间充质干细胞无血清培养基，配制完成后在4℃有效期为30天。


4.根据权利要求2所述的一种应用三维细胞的人骨髓间充质干细胞培养工艺，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞采用无血清培养体系利用二维细胞培养技术连续传代扩增至P3代收获包括以下步骤：
（1）紧接上述1的操作，P0代原代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（2）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（3）待确认P0代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的GibcoTrypLE™SelectEnzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（4）消化获得的P0代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（5）按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在10000~20000个/平方厘米；
（6）调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P1代细胞传代接种；
（7）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（8）P1代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（9）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（10）待确认P1代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的GibcoTrypLE™SelectEnzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min，完成消化后用回收的旧细胞培养上清液终止消化，添加终止消化的培养上清体积不小于消化液；
（11）消化获得的P1代细胞悬液离心，条件为1100rpm，5min，室温，去除所有上清液后用无血清培养基重悬细胞沉淀计数；
（12）按照计数的结果传代接种新的T150培养瓶，接种的密度控制在10000~20000个/平方厘米；
（13）调整细胞密度添加细胞悬液至T150培养瓶，补充无血清完全培养基至24ml/瓶，完成P2代细胞传代接种；
（14）完成接种的细胞培养瓶置于饱和湿度37℃、5%体积分数二氧化碳的二氧化碳培养箱内进行后续的二维细胞培养；
（15）P2代骨髓间充质干细胞在融合率到达90%前维持每3天进行一次半量换液；
（16）半量换液的操作为按照每T150培养瓶中抽取12ml的培养上清，再补充12ml新鲜的无血清培养基；
（17）待确认P2代细胞融合率达到90%以上，经生理盐水洗涤去除残留的血清成分用稀释为工作液浓度的GibcoTrypLE™SelectEnzyme重组蛋白胰酶消化培养瓶内的细胞，每瓶T150加入8ml的消化液消化3min...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东福，陈智聪，许峻荣，黄里，卢丽红，
申请(专利权)人：广东壹加再生医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44