一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，旨在鸡胚孵化至4.5天时,取下生殖嵴，通过血液进行性别鉴定后分离出雌雄鸡胚的PGCs，将为早期干细胞的进一步应用奠定基础。本方法适用于家禽雌雄原始生殖细胞的分离，方法新颖科学，结果准确可靠。本发明专利技术可以准确的分离鸡雌雄原始生殖细胞，为PGCs在医学以及发育生物学、禽类嵌合体制备、转基因禽类的方面研究提供准确的原材料。此外，本发明专利技术中的细胞分离方法也可以应用于其他禽类研究中，具有很好的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法
本专利技术涉及一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，属于生物

技术介绍
PGCs(原始生殖细胞)是一切生殖细胞的祖细胞，具有独特的生物学特性。1954年Chiquoine首次通过碱性磷酸酶(TNAP)活性检测出小鼠8.5dpc(dayspostcoitum8.5)的PGCs。1870年Waldeyer首次在鸡胚的生殖上皮发现了PGCs；直到1981年Eyalgiladi等对鸡鹌鹑嵌合体进行研究，通过Feulgen法对鹌鹑PGCs进行标记示踪发现PGCs起源于X期的胚盘上胚层，且随后的研究发现只有胚盘明区的中央区域才能产生PGCs。由于鸡是卵生高等动物，其受精卵在动物体内发育到囊胚期产出，而晚期胚胎发育过程独立于母体之外，这种特殊的生物学繁殖方式使得人们可以体外获取PGCs，给研究者们在研究发育生物学、禽类嵌合体制备、转基因禽类等方面提供巨大的便利。研究PGCs是解决后生动物甚至人类自身生殖细胞发育过程一些列问题的最好途径，PGCs是最适合转基因家禽的研究，转基因鸡可以作为一种生物反应器。由于雌雄鸡胚的PG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：/n(1)孵化；将受精蛋置于孵化箱中孵化；/n(2)消毒；对经步骤(1)孵化后的受精蛋使用1％新洁尔灭清洗蛋壳，再用75％酒精擦拭蛋壳表面进行消毒；/n(3)取样；在超净台取出受精蛋的胚胎，用移液枪吸取胚胎周围的血液，用于性别鉴定；在显微镜下分离出生殖嵴；/n(4)分离细胞；将生殖嵴用胰蛋白酶消化3分钟，用100目过滤筛进行过滤，1600转/每分钟离心6分钟收集上清液。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)孵化；将受精蛋置于孵化箱中孵化；
(2)消毒；对经步骤(1)孵化后的受精蛋使用1％新洁尔灭清洗蛋壳，再用75％酒精擦拭蛋壳表面进行消毒；
(3)取样；在超净台取出受精蛋的胚胎，用移液枪吸取胚胎周围的血液，用于性别鉴定；在显微镜下分离出生殖嵴；
(4)分离细胞；将生殖嵴用胰蛋白酶消化3分钟，用100目过滤筛进行过滤，1600转/每分钟离心6分钟收集上清液。


2.根据权利要求1所述的一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，其特征是，步骤(1)中，取新鲜受精蛋在孵化箱中进行孵化，孵化至4.5日龄取出。


3.根据权利要求1所述的一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，其特征是，步骤(3)中，在超净台中将受精蛋大头朝上拿住，使用镊子从中间部分敲开，敲开后用镊子顶住顶部的血管网，取下上半部分的蛋壳，用移液枪吸取100微升的血液于pcr管中，取出鸡胚，置于装有PBS溶液的培养皿中洗涤两次。


4.根据权利要求1所述的一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法，其特征是，步骤(3)中，性别鉴定时，基于PCR的鸡胚性别鉴定快速方法流程如下：以血液为模板，直接进行PCR扩增，PCR酶为MightyAmpDNAPolymerase，PCR引物为上游Forward:TGCAGAAGCAATATTACAAG；下游Reward:AATTCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，石祥，左其生，张亚妮，孙红艳，靳锴，张明，姜景译，袁霞，丁颖，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32