脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法技术

本发明专利技术属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。本发明专利技术提供的脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份，L‑岩藻糖2～6份，硫辛酸1～5份，还原型谷胱甘肽0.1～2份。本发明专利技术提供的脂肪间充质干细胞冻存液不含有动物血清，安全性高，成本低，且制备方法简单，与常规的冻存方法相比，采用本发明专利技术脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞可明显减少冻存液对细胞的损伤，复苏后细胞回收率高。

【技术实现步骤摘要】
脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，是多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。脂肪间充质干细胞(Adipose-derivedMesesnchymalStemCells,ADMSCs)是指存在于脂肪组织中的MSCs，具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化成骨细胞、软骨细胞脂肪细胞等。由于脂肪组织几乎遍布动物全身，在整个声明过程中有极强的可塑性。ADMSCs具有很多优点：第一，部分避免了伦理及法律上的问题；第二，来源广泛，从医学角度来说，吸脂术与抽骨髓相比，从腹部获取脂肪较为容易，给别人带来的损伤也较小。第三，ADMSCs具有多向分化潜能，在不同条件下可被诱导分化为成骨细胞软骨细胞脂肪细胞等，中胚层细胞也可向神经细胞、肝细胞等其他胚层分化；第四，ADMSCs表面分子标记与其他组织来源的MSCS相似；第五，脂肪来源的MSCs与骨髓来源的MSCs，相比具有更长的培养时间以及更高的增殖能力。目前现有技术中，脂肪间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以二甲基亚砜和血清为主要成分，另一种是以培养基、二甲基亚砜和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。中国专利申请CN109644982A公开了一种用于脂肪干细胞的冻存方法，所述细胞冻存液由90％胎牛血清FBS和10％二甲基亚砜DMSO所组成。虽然该冻存液使用较为普遍，但其主要成分血清具有成分复杂，质量不稳定，有被动物病原污染的可能性，具有价格昂贵，成本较高等缺点。中国专利申请CN106386783A公开了一种间充质干细胞的冻存保护液，所述冻存保护液包括1640培养液69％，二甲基亚砜10％，人血清白蛋白10％，硫辛酸10％，成纤维细胞生长因子1％。所述的二甲基亚砜虽然是冻存细胞时常用的保护剂，但是二甲基亚砜会对细胞产生毒性作用，会对冻存的干细胞造成不可逆的损伤，导致复苏后细胞回收率及细胞活率较低。综上所述，现有技术中脂肪间充质干细胞的冻存液存在成本较高、效果均不理想等普遍问题，如何最大限度的避免干细胞冻存与复苏过程中的损伤，提高复苏后细胞回收率及细胞活率成为亟待解决的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。本专利技术提供的脂肪间充质干细胞冻存液，不含有动物血清，安全性高，成本低，且制备方法简单，与常规的冻存方法相比，采用本专利技术脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞可明显减少冻存液对细胞的损伤作用，复苏后细胞回收率高。本专利技术的技术方案是：一种脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份。进一步地，所述的脂肪间充质干细胞冻存液，由如下组分及其重量份数组成：基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。进一步地，所述基础培养基为Lonza基础培养基或DMEM基础培养基。进一步地，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10～16:9～13:2～6组成。进一步地，所述的茯苓提取物的制备步骤如下：取茯苓粉碎后，加入其重量7～12倍的体积份数为60～80％乙醇水溶液浸泡3～5小时，然后在50～70℃下提取1-3次，每次提取时间为1-3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；进一步地，所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15～20倍的水浸泡1～3小时，然后加热到90℃，回流提取1～2小时，过滤得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10～15倍体积的蒸馏水继续回流1～2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10～1/30，再加入3～6倍体积的70～80％乙醇混合均匀，静置3～5小时，3000～5000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在60～80℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。更进一步地，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。本专利技术还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用本专利技术所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。进一步地，所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。进一步地，所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×105～107个/mL。进一步地，所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以1～4℃/min的速率的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h。本专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞冻存液，除冻存细胞所需的基础物质外，本专利技术还添加了低温保护剂，为非渗透性保护液，由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按一定比例组成，能够优先与本专利技术中脂肪间充质干细胞冻存液中的水分子反应，从而降低其中自由水的含量使冰点降低，减少冰晶的形成，在脂肪间充质干细胞外部保护，减少冰晶对其细胞膜产生损伤，从而有效提高干细胞的抗冻性。进一步地，添加的茯苓提取物、裂褶菌多糖等天然物质，能够使冻存液中的电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。同时，本申请中添加的L-岩藻糖为渗透性保护液，是六碳糖的一种，作为糖蛋白中糖链的组成部分广泛存在于各类细胞表面的质膜上，能够在细胞冻存液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，减低细胞内外为结冰溶液中电解质，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，有效防止细胞的冻伤。综上，本专利技术提供含有双重保护成份的冻存液，通过添加的低温保护剂和L-岩藻糖协同作用，能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份。


2.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下组分及其重量份数组成：基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。


3.如权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为Lonza基础培养基或DMEM基础培养基。


4.如权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10～16:9～13:2～6组成。


5.如权利要求4所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的茯苓提取物的制备步骤如下：
取茯苓粉碎后，加入其重量7～12倍的体积份数为60～80％乙醇水溶液浸泡3～5小时，然后在50～70℃下提取1～3次，每次提取时间为1～3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；
所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：
向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15～20倍的水浸泡1～3小时，然后加热到90℃，回流提取1～2小时，过滤得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10～15倍体积的蒸馏水继续回流1～2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10～1/30，再加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张印，
申请(专利权)人：广州同康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44