一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50‑60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5‑4.0mg/mL、白果内酯25‑30ng/mL、焦磷酸钠35‑45ng/mL、苜蓿皂苷80‑90μg/mL、硫辛酸100‑110μg/mL。本发明专利技术提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，不添加动物源血清和DMSO，并且复苏后细胞存活率高。本发明专利技术的冻存液中添加乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，对细胞无损伤，提高细胞的通透性，维持细胞内外的渗透压稳定，有助于细胞维持活性。添加白果内酯和焦磷酸钠复配使用，防止细胞蛋白质分子变性失活，有助于细胞在长时间冻存后快速恢复活性。本发明专利技术的冻存液还添加有苜蓿皂苷和硫辛酸，清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果。本发明专利技术还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，方法简便，易于操作。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法
本专利技术涉及干细胞领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法。
技术介绍
脂肪间充质干细胞(AdiposeMesenchymalStemCells，ADSC)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。目前已发现脂肪间充质干细胞可以治疗包括人体神经系统、免疫系统、消化系统、运动系统等系统的80多种疾病，脂肪间充质干细胞作为重要的再生医学资源在疾病治疗和人体抗衰老的应用领域有非常重要的使用价值。现有技术中使用的脂肪间充质干细胞冻存液多含有胎牛血清和二甲基亚砜(DMSO)。胎牛血清含有多种生长因子，常用于体外细胞培养，为细胞的贴壁或铺展在培养基质上提供所需的生长因子；也可用于干细胞冻存，可以减慢细胞活性下降的问题，能够长时间维持细胞活率。但是，研究表明长期与胎牛血清接触的脂肪间充质干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后会发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致干细胞移植的成功率降低，易引起诸多不良反应。而且胎牛血清大多源于进口，价格昂贵，增加科研成本。DMSO因其具有抗冻作用，常用于细胞的冻存。但是，DMSO具有毒性，会对冻存细胞造成损伤，而外源动物血清对细胞有污染的可能，长期使用影响细胞活性，后续使用影响细胞临床治疗推广。现有的脂肪间充质干细胞冻存液即使不含有胎牛血清或DMSO，但是冻存效果不理想，存在长时间保存细胞复苏率差，存活率低等问题，极大地限制了其在临床上的推广应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存液，不添加胎牛血清和DMSO，并且冻存后的细胞活性保持较好，经复苏后存活率高。本专利技术的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50-60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5-4.0mg/mL、白果内酯25-30ng/mL、焦磷酸钠35-45ng/mL、苜蓿皂苷80-90μg/mL、硫辛酸100-110μg/mL。进一步地，上述脂肪间充质干细胞冻存液由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液进行冻存。一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入脂肪间充质干细胞，在4-6℃预冷处理；(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-20～-40℃预冻处理；(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以2-4℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2-3h，然后转移至液氮中冷冻保存。进一步地，所述步骤(1)中取处于对数生长期的脂肪间充质干细胞进行冻存。进一步地，所述脂肪间充质干细胞加入量为：每毫升培养基1.0-2.0×106个。进一步地，所述步骤(1)中预冷处理的时间为5-10min，步骤(2)中预冻处理的时间为1-2h。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，不添加动物源血清和DMSO，并且复苏后细胞存活率高。本专利技术的冻存液中添加乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，对细胞无损伤，提高细胞的通透性，维持细胞内外的渗透压稳定，减少因细胞内液冰晶的形成、渗透压改变等导致的损伤，有助于细胞维持活性。添加白果内酯和焦磷酸钠复配使用，利用焦磷酸钠的保水性和白果内酯对细胞的刺激性，防止细胞蛋白质分子变性失活，有助于细胞在长时间冻存后快速恢复活性。本专利技术的冻存液还添加有苜蓿皂苷和硫辛酸，清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果。上述冻存液的成分在脂肪间充质干细胞冻存过程中协同作用，无需添加外源血清和DMSO，并且能保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。本专利技术还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，限定了冻存液中各成分的加入时机，进一步降低冻存过程对细胞的损伤，有助于提高细胞复苏后的存活率，方法简便，易于操作。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例1一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基1.5×106个，在4℃预冷处理10min；(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-30℃预冻处理1.5h；(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以3℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2h，然后转移至液氮中冷冻保存。实施例2一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50μg/mL、乙酰壳糖胺1.5mg/mL、白果内酯25ng/mL、焦磷酸钠35ng/mL、苜蓿皂苷80μg/mL、硫辛酸100μg/mL。一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基1.0×106个，在6℃预冷处理5min；(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-20℃预冻处理2h；(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以2℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2.5h，然后转移至液氮中冷冻保存。实施例3一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚60μg/mL、乙酰壳糖胺4.0mg/mL、白果内酯30ng/mL、焦磷酸钠45ng/mL、苜蓿皂苷90μg/mL、硫辛酸110μg/mL。一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50-60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5-4.0mg/mL、白果内酯25-30ng/mL、焦磷酸钠35-45ng/mL、苜蓿皂苷80-90μg/mL、硫辛酸100-110μg/mL。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50-60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5-4.0mg/mL、白果内酯25-30ng/mL、焦磷酸钠35-45ng/mL、苜蓿皂苷80-90μg/mL、硫辛酸100-110μg/mL。


2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。


3.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至2所述冻存液进行冻存。


4.根据权利要求3所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁杰，马超群，
申请(专利权)人：郑州佐爵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41