一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶；(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块；(13)制备脐带间充质干细胞；(14)将脐带间充质干细胞加入至冻存液中进行冻存处理。复苏方法包括以下操作步骤：(21)将冻存管温水浴解冻；(22)离心得到脐带间充质干细胞；(23)向脐带间充质干细胞中加入完全培养基，进行培养。本发明专利技术提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，直接对脐带间充质干细胞组织进行冻存处理，操作步骤简单，能有效的提升医治效率。

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法
本专利技术属于临床输注的脐带间充质干细胞冻存和复苏
，具体涉及一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法。
技术介绍
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。人脐带华通氏胶中可分离出脐带间充质干细胞(huMSCs)，并且因其来源广泛，易获得，且具有间充质干细胞的所有特性，因此成为目前比较理想的干细胞来源。目前，脐带间充质干细胞组织的冻存方法多采用传统的细胞冻存方法，即先从华通氏胶中分离培养出脐带间充质干细胞组织，然后将干细胞进行冻存，从脐带获取到细胞冻存涉及华通氏胶分离，细胞换液、传代、收获、冻存等多个步骤。针对传统细胞冻存周期长，成本高的特点，直接冻存脐带组织，待临床需要时再进一步复苏培养的组织冻存方式表现出周期短，成本低的优势，然而目前没有一种行之有效的从华通氏胶中分离出的脐带间充质干细胞组织的直接冻存方法。
技术实现思路
为了解决现有技术的缺陷，本专利技术提供一种低炼耗、高效率、并适合工业化生产的脐带组织的冻存方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm3小块，生理盐水洗涤3-5遍；(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8-10的质量比制成；(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3-5℃的环境中平衡处理13-16min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入深低温冰箱内，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1-3份二甲基亚砜，0.8-1.2份低分子右旋糖酐-40，15-20份基础液；上述基础液包括85-95份基础培养基、8-12份血清替代物、0.8-1.5份谷氨酰胺；所述复苏方法包括以下操作步骤：(21)将冻存管温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，离心处理，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾1-8份、水90-100份、甲醇25-35份；(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm2培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到78-82％时，复苏完成。具体地，上述所有步骤中的离心操作，离心的转速均为1400-1600rpm，离心的时间均为4-6min。具体地，上述脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3-5cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平。具体地，上述基础培养基为MS培养基、B5培养基、NT培养基中的任意一种。具体地，上述深低温冰箱内的温度为零下80℃，初步冻存处理的时间为3-5小时。具体地，上述步骤(21)中，水浴解冻的温度为37℃。具体地，所述完全培养基为由α-MEM培养基和胎牛血清按照8-9:1的体积比混合后，向其中加入抗生素后制成，其中抗生素的浓度为50-200U/mL。具体地，上述步骤(23)中，脐带间充质干细胞组织培养过程中的温度为36-38℃，二氧化碳的体积浓度为4-6％。由以上的技术方案可知，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，直接对脐带间充质干细胞进行冻存处理，操作步骤简单，能有效的提升医治效率；2、本专利技术提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，可有效的提升复苏后脐带间充质干细胞的活性，细胞增值能力强，生长良好，向成骨、成脂、成软骨方向分化的潜力强；3、本专利技术提供的洗涤液，能有效的除去脐带间充质干细胞表面的冻存液，防止冻存液对脐带间充质干细胞组织的复苏产生不利的影响；4、本专利技术提供的冻存液，对细胞损伤小，冻存效果好，能够为临床提供质量高的脐带间充质干细胞组织。附图说明图1为复苏后脐带间充质干细胞组织的细胞生长曲线示意图。图2为脐带间充质干细胞复苏后的成骨成脂成软骨染色图。图3为脐带间充质干细胞复苏后细胞表型流式检测结果图。图4为脐带间充质干细胞复苏后培养过程中形态结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1一种脐带间充质干细胞组织的冻存方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1mm3小块，生理盐水洗涤3遍，其中脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平；(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8的质量比制成；(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3℃的环境中平衡处理13min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入零下80℃的深低温冰箱内初步冻存处理的3小时，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1份二甲基亚砜，0.8份低分子右旋糖酐-40，15份基础液；上述基础液包括85份MS培养基、8份血清替代物、0.8份谷氨酰胺。上述离心的转速均为1500rpm，离心的时间均为5min。实施例2实施例1中脐带间充质干细胞组织的冻存后的复苏方法包括以下操作步骤：(21)将冻存管37℃温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，1500rpm离心处理5min，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，/n所述冻存方法包括以下操作步骤：/n(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，
所述冻存方法包括以下操作步骤：
(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm3小块，生理盐水洗涤3-5遍；
(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8-10的质量比制成；
(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3-5℃的环境中平衡处理13-16min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；
(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入深低温冰箱内，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1-3份二甲基亚砜，0.8-1.2份低分子右旋糖酐-40，15-20份基础液；
上述基础液包括85-95份基础培养基、8-12份血清替代物、0.8-1.5份谷氨酰胺；
所述复苏方法包括以下操作步骤：
(21)将冻存管温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；
(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，离心处理，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾1-8份、水90-100份、甲醇25-35份；
(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm2培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到78-82％时，复苏完...

【专利技术属性】
技术研发人员：王帅，吕玲，张君，张秀涛，庄肃静，陈书勇，杨卫娟，李小博，雒猛，
申请(专利权)人：山东省齐鲁干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37