溴虫腈半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了溴虫腈半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术提供的溴虫腈半抗原既最大程度保留了溴虫腈的特征结构，使得溴虫腈半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用溴虫腈半抗原与载体蛋白偶联后得到的溴虫腈人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测溴虫腈抗体的灵敏度可达1μg/L，与其他吡咯类农药的交叉反应率低，为后续建立溴虫腈的各种免疫分析方法提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
溴虫腈半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全检测领域。更具体地，本专利技术涉及溴虫腈半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
溴虫腈(chlorfenapyr)，又名虫螨腈，是一种芳基吡咯类杀虫剂、杀螨剂，具有杀虫谱广、药效高、时效长、用药量低、无交互抗性、对作物安全等优点，并兼有胃毒和触杀作用，在蔬菜、果树、棉花等多种作物上已登记使用。随着溴虫腈使用范围和使用量的增加，其在食品和环境中的半衰期长，残留的毒副作用也逐步显现。医学研究表明，溴虫腈会对小鼠的肝、肾、脾细胞DNA和野鸭繁殖性能产生影响。我国国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了蔬菜、水果中溴虫腈的残留限量为0.1～10mg/kg。目前，国内外关于溴虫腈残留分析检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法及高效液相色谱法等，但都存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为溴虫腈残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测溴虫腈残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的溴虫腈半抗原。有研究发现，溴虫腈的芳基吡咯是其特征结构，对免疫反应起着非常重要的作用。而刘顺宇等采用将溴虫腈吡咯环上的腈基还原成氨基，进而与载体蛋白偶联，这样修饰位点与溴虫腈分子的特征结构距离较近，不利于半抗原分子特征结构的暴露，使得动物的免疫系统对半抗原分子特征结构的识别难度加大，抗体的亲和性和特异性降低。因此，要制备高特异性的抗体，溴虫腈分子中的修饰位点应远离其特征结构芳基吡咯，使半抗原的特征分子结构部分得以充分暴露，同时避免载体蛋白对半抗原分子特征结构的屏蔽作用。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留溴虫腈的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。为了实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种溴虫腈半抗原，其具有如下结构式：本专利技术提供的溴虫腈半抗原在溴虫腈的吡咯环上的乙氧基甲基引入羧基活性基团，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该溴虫腈半抗原保留了溴虫腈的所有特征基团，最小改变溴虫腈原有结构特征，同时与载体蛋白偶联后，突出的是溴虫腈本身独有的芳基吡咯结构，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。第二方面，本专利技术提供上述溴虫腈半抗原的制备方法，其是由炔基溴虫腈在酸性条件下经高锰酸钾氧化得到。进一步地，该制备方法为：取炔基溴虫腈加1mol/L稀盐酸溶解，搅拌下加入高锰酸钾，充分搅拌后加热，60℃反应2h，反应完毕后加入6mol/LNaOH溶液调节pH到6，进行分离纯化得到溴虫腈半抗原；其中，所述炔基溴虫腈、高锰酸钾的摩尔比为1:1。进一步地，该制备方法的具体步骤如下：取炔基溴虫腈0.46g加1mol/L稀盐酸70mL溶解，搅拌下加入高锰酸钾0.16g，充分搅拌后加热，60℃反应2h，反应完毕后加入6mol/LNaOH溶液调节pH到6，加乙酸乙酯80mL萃取，分去水相，有机相加水60mL洗涤一次，分去水相，加无水硫酸钠干燥蒸干，用硅胶柱纯化，用二氯甲烷和甲醇体积比为10:1的混合溶剂洗脱分离，得到溴虫腈半抗原。半抗原的制备方法主要包括：(1)利用待测物现有结构或中间体，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团；(2)利用其代谢产物或结构类似物作先导物，对其进行改造，得到需要的半抗原；(3)利用原料、试剂重新合成，在适当的位置引入带有功能基团的小分子。本专利技术由炔基溴虫腈在酸性条件下经高锰酸钾氧化后合成了带有羧基的溴虫腈半抗原，与后两种方法相比，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的溴虫腈半抗原的纯度和收率较高。第三方面，本专利技术提供一种溴虫腈人工抗原，其是载体蛋白和上述溴虫腈半抗原偶联得到的偶联物。所述溴虫腈人工抗原可以作为免疫原，也可以作为包被原。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白；优选人血清白蛋白、卵清蛋白。更具体的如：溴虫腈半抗原-人血清白蛋白(HSA)形成的免疫原；溴虫腈半抗原-卵清蛋白(OVA)形成的包被原。溴虫腈半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予溴虫腈半抗原分子以免疫原性，还需要将该溴虫腈半抗原分子与合适的载体蛋白分子偶联、结合在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的溴虫腈人工抗原。第四方面，本专利技术提供上述溴虫腈人工抗原的制备方法，采用活性酯法将载体蛋白偶联于上述溴虫腈半抗原的羧基上。第五方面，本专利技术提供一种溴虫腈抗体，它是由上述溴虫腈人工抗原经动物免疫得到，其能与溴虫腈发生特异性免疫反应。进一步地，所述溴虫腈抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。另外，对于所述溴虫腈抗体，可以采用本领域常规方法来进行制备。在一个具体的实施方案中，所述溴虫腈抗体为特异性针对上述溴虫腈半抗原的溴虫腈人工抗原的鼠源单克隆抗体。采用本专利技术的溴虫腈人工抗原得到的溴虫腈抗体的效价、特异性、亲和力都较好，与其他吡咯类农药的交叉反应率低。第六方面，本专利技术提供上述溴虫腈抗体在检测溴虫腈残留中的应用。本专利技术通过溴虫腈人工抗原诱导免疫动物产生抗体，从而用于溴虫腈免疫检测分析中。所述的溴虫腈免疫检测包括但不限于溴虫腈ELISA试剂盒、溴虫腈胶体金试纸条、溴虫腈时间分辨荧光试纸条。借由上述技术方案，本专利技术至少具有如下优点及有益效果：本专利技术提供的溴虫腈半抗原既最大程度保留了溴虫腈的特征结构，使得溴虫腈半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用溴虫腈半抗原与载体蛋白偶联后得到的溴虫腈人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立溴虫腈的各种免疫分析方法提供基础。本专利技术中溴虫腈半抗原的制备方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的溴虫腈半抗原的纯度和收率较高。采用本专利技术的溴虫腈人工抗原得到的溴虫腈抗体的效价、特异性、亲和力都较好，灵敏度可达到1μg/L，与其他吡咯类农药的交叉反应率低。附图说明图1是本专利技术溴虫腈半抗原的合成路线具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细说明本专利技术，但实施例仅是本专利技术的优选实施方式，并不是对本专利技术的限定。实施例1一种溴虫腈半抗原的制备方法，步骤如下：取炔基溴虫腈0.46g加1mol/L稀盐酸70本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溴虫腈半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：/n

【技术特征摘要】
1.一种溴虫腈半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：





2.如权利要求1所述的溴虫腈半抗原的制备方法，其特征在于，其是由炔基溴虫腈在酸性条件下经高锰酸钾氧化得到。


3.如权利要求2所述的溴虫腈半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法为：取炔基溴虫腈加1mol/L稀盐酸溶解，搅拌下加入高锰酸钾，充分搅拌后加热，60℃反应2h，反应完毕后加入6mol/LNaOH溶液调节pH到6，进行分离纯化得到溴虫腈半抗原；其中，所述炔基溴虫腈、高锰酸钾的摩尔比为1:1。


4.如权利要求2所述的溴虫腈半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：取炔基溴虫腈0.46g加1mol/L稀盐酸70mL溶解，搅拌下加入高锰酸钾0.16g，充分搅拌后加热，60℃反应2h，反应完毕后加入6mol/LNaOH溶液调节pH到6，加乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，万宇平，崔廷婷，刘玉梅，崔娜，凡静静，张坤，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，广州勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11