Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Z‑VAD‑FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用。该发明专利技术通过Z‑VAD‑FMK抑制细胞凋亡，而无论在细胞还是动物水平，细胞凋亡都能抑制不同方式激发的NF‑κB及IFN‑1信号通路，使得人类1型单纯疱疹病毒引起的天然免疫反应被细胞凋亡所负调控，从而实现通过Z‑VAD‑FMK增强人类1型单纯疱疹病毒激发的天然免疫通路，起到有效抗病毒作用的目的。

【技术实现步骤摘要】
Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用。
技术介绍
疱疹病毒(Herpesvirus)是一大类有包囊dsDNA病毒，根据其生物学特性，归类为疱疹病毒科(Herpesviridae)。目前共发现100多种疱疹病毒，单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus，HSV)是疱疹病毒的典型代表，主要侵害皮肤、黏膜以及神经组织，严重影响人类的生命健康。HSV属于甲型疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)，HSV病毒根据抗原性的不同可分为：1型人类单纯疱疹病毒(HSV-1)和2型人类单纯疱疹病毒(HSV-2)。HSV-1主要感染粘膜上皮细胞，并在感觉神经元中建立终身感染，HSV-1感染最常见的症状为口腔颌面部形成疼痛的水泡状病变。在我国一般人群中，超过80％已经潜伏感染了HSV-1，在老年和免疫功能低下的人群中，HSV-1感染可导致严重疾病，如疱疹性脑炎和角膜炎，甚至引起的失明。HSV-1已成为影响人民生命健康的重要因素，目前并没有针对HSV-1的有效疫苗和药物。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种主要表现形式，其对多细胞生物的发育及维持内部环境稳定至关重要，同时也被认为参与多种抗病毒天然免疫通路。细胞凋亡以依赖于一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)的形式通过外源或内源途径激活。外源性途径需要外部刺激来激活死亡受体，如肿瘤坏死因子(TNF)受体1(TNFR1)、TRAIL受体1(TRAILR1)、TRAILR2和FAS，从而激活Caspases-8和-10，随后激活效应Caspases-3和-7。细胞应激(如DNA损伤、内质网应激和细胞因子剥夺)激活内源性(或线粒体)途径，从而增加线粒体外膜通透性(MOMP)，在MOMP作用后，细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，诱导凋亡体的形成和Caspase-9的激活，从而激活效应Caspases-3和-7。Z-VAD-FMK是研究细胞凋亡的一种关键化合物，是一种细胞渗透性的，不可逆泛caspase抑制剂，能以不可逆的形式与活化的Caspases结合从而阻断细胞凋亡。目前已有大量细胞内研究证明了Z-VAD-FMK抑制细胞凋亡的作用，如在THP.1和JurkatT细胞中阻断细胞凋亡、在S2细胞中将转染细胞的生存百分数从26％提高到63％、在人类嗜中性粒细胞中较低浓度(1-30μM)时完全抑制TNFα刺激的细胞凋亡、在早期角膜基质细胞中抑制细胞凋亡等。而天然免疫通路与细胞凋亡之间存在着复杂的互作网络，如NF-κB可抑制TNF诱导的细胞凋亡，并诱导凋亡抑制蛋白的表达，I型干扰素(IFN-I)及IRF3可诱导TRAILR1、TRAILR1、Caspases-8等多种促凋亡蛋白表达。因此，本专利技术研究一种新型的抗人类1型单纯疱疹病毒的治疗药物，来增强天然免疫通路从而达到抗病毒的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发一种人类1型单纯疱疹病毒抑制剂，来增强人类1型单纯疱疹病毒激发的天然免疫通路，从而起到有效抗病毒的作用。为此，本专利技术提供了一种Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用。进一步的，所述Z-VAD-FMK通过抑制细胞凋亡对天然免疫通路负调控而抑制人类1型单纯疱疹病毒的表达和复制。进一步的，所述Z-VAD-FMK抑制人类1型单纯疱疹病毒活性浓度为25～400μM。进一步的，所述人类1型单纯疱疹病毒抑制剂包括活性成分以及药学上可接受的辅料，其中活性成分包括Z-VAD-FMK。本专利技术中，Z-VAD-FMK的化学结构式如式(1)所示。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术中Z-VAD-FMK是一种广泛用于抑制细胞凋亡的泛Caspases抑制剂，通过研究表明细胞凋亡能负调控天然免疫通路，而天然免疫通路最主要的功能就是抗病毒，从而通过Z-VAD-FMK抑制细胞凋亡可增强病毒激发的天然免疫通路，起到更有效的抗病毒作用，达到预防和治疗HSV1病毒感染所引起疾病的目的。(2)本专利技术中通过荧光定量PCR结果表明Z-VAD-FMK能在A549细胞中显著抑制HSV-1基因的复制水平，并确定了Z-VAD-FMK是通过抑制细胞凋亡对天然免疫通路负调控作用，起到抗病毒效果。以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1是Caspase3切割降解NF-κB通路中关键蛋白p65、RelB、C-Rel的westernbolt测定结果图；图2是Caspase3切割降解IFN-I通路中的关键蛋白IRF3的westernbolt测定结果图；图3是Caspase3降低趋化因子CXCL10的mRNA水平的荧光定量PCR测定结果图；图4是在体内细胞凋亡能抑制NF-κB及IFN-1信号通路的ELISA测定结果图；图5是Z-VAD-FMK抑制HSV-1病毒复制水平的荧光定量PCR测定结果图。图6是不同浓度的Z-VAD-FMK抑制HSV-1病毒复制水平的IC50测定结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：本实施例探究了Caspase3对NF-κB信号通路中关键蛋白p65、RelB、C-Rel的水解作用，具体过程如下：1.实验材料293T细胞、含10％Gibco血清和2％双抗的MEM培养基、转染试剂、含2％血清的MEM培养基、表达带HA标签的Caspase3和Caspase3活性缺失(Caspase3mut)的质粒、表达IL-1β的质粒、蛋白裂解液、p65内源抗体、RelB内源抗体、C-Rel内源抗体、HA抗体、Tubulin抗体、westernbolt相关试剂。2.实验过程(1)用293T细胞铺6孔板；(2)待其长到70％-80％融合度时，将含10％Gibco血清和2％双抗的MEM培养基换成含2％血清的MEM培养基(每孔培养基的加入量是1ml)；(3)利用转染试剂将1μg空载、Caspase3、Caspase3mut质粒分别转入6孔板293T细胞内；(4)24h后，将IL-1β质粒转入相应6孔板293T细胞内；(5)24h后，收集细胞，加入200μl蛋白裂解液，裂解30min，加入相应量的5xSDSloading，沸水煮样10min，冰上放置2min；(6)配置10％的SDS-PAGE胶，将10μl煮好的蛋白样品(即p65内源抗体、RelB内源抗体、C-Rel内源抗体、HA抗体、Tubulin抗体)点入胶孔中，跑胶至marker本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.Z-VAD-FMK在制备人类1型单纯疱疹病毒抑制剂中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Z-VAD-FMK通过抑制细胞凋亡对天然免疫通路负调控而抑制人类1型单纯疱疹病毒的表达和复制。


3.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国东，刘愈杰，幸晓莹，郑从义，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42