非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一对非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体1B11、4F7及其可变区序列，以及含该对单克隆抗体的ELISA试剂盒、胶体金试纸条，其中，ELISA试剂盒包括包被单克隆抗体1B11的包被板、酶标单克隆抗体4F7、阳性对照、阴性对照及对抗原抗体反应进行检测的检测试剂。胶体金试纸条包括金标单克隆抗体4F7作为金标垫，以及含固定单克隆抗体1B11作为检测线、固定羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗作为质控线的硝酸纤维素膜。本发明专利技术的ELISA试剂盒、胶体金试纸条可高灵敏度地检测非洲猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒P30蛋白，适用于感染不同类型非洲猪瘟病毒猪只的检测，还可适用于不同地区不同自然环境下猪的检测。

Monoclonal antibody against P30 protein of African classical swine fever virus and its application

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体或抗体片段，以及用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病，以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征(与猪瘟表现相似)，病程短、发病率高、病死率高(可高达100％)，特别地传染源多、传播途径多、传播方式多，一旦发生损失惨重。ASF于1921年在肯尼亚首次被发现，随后在非洲南部和东部的许多国家均发现ASFV的存在。自2018年8月3日中国确诊首例发生于辽宁省沈阳市沈北新区的非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟迅速在国内各省市蔓延，疫情持续扩大，一旦确诊就要采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，对整个行业的影响是地震级的。ASF为世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病，为我国规定的动物一类疾病，受到世界各国的高度重视。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是目前已知的唯一一种DNA虫媒病毒，是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，其基因组长约170kb～193kb，是动物病毒中基因组最大的病毒之一，其基因组是口蹄疫病毒的24倍、猪瘟病毒的15倍。ASFV主要感染猪和野猪，可同时在脊椎动物和无脊椎动物中复制。目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。对ASF的控制目前只能依赖快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。ASFV的实验室诊断检测方法主要分为病原学检测、血清学检测、核酸检测以及胶体金试纸条检测。截止目前，唯一曾获批的胶体金检测试纸条为北京森康生物技术开发有限公司研发的非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条，该试纸条的敏感性仅66.67％(http://www.cadc.net.cn/sites/MainSite/tzgg/tz/201901/t20190104_102258.html、http://www.cadc.net.cn/sites/MainSite/tzgg/tz/201906/t20190612_104185.html)。特别地，使用过程中，海南省乐东黎族自治县农业农村局明文指出森康试纸条与海南省动物疫病预防中心的检测结果绝大部分相反，存在严重的假阴性，造成该县排查检测误判，使该县防非洲猪瘟的工作非常被动(http://www.sohu.com/a/313930753_168900)。总而言之，目前临床最快速、最简便的胶体金试纸条实际检测效果较差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一对特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体，以及含单克隆抗体的ELISA试剂盒、胶体金检测试纸条及其应用。本专利技术涉及一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体1B11的可变区序列，其中，所述单克隆抗体1B11重链可变区为SEQ.IDNo.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体1B11轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。本专利技术涉及一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.IDNo.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段的轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。作为本专利技术的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的能力。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体1B11。所述单克隆抗体1B11重链可变区为SEQ.IDNo.1或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.IDNo.2或其简并序列编码；对ASFVP30蛋白的ELISA效价为1∶1024000，具有良好的反应性，还可用于高效价地用于免疫组化对不同组织的检测。作为本专利技术的一种实施方式，所述单链抗体1B11重链可变区为SEQ.IDNo.1所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码。该单链抗体1B11对ASFVP30蛋白的ELISA效价为1∶204800，表明其与ASFVP30蛋白具有良好的反应特性。本专利技术涉及一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体4F7的可变区序列，其中，所述单克隆抗体4F7重链可变区为SEQ.IDNo.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4F7轻链可变区为SEQ.IDNo.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。本专利技术涉及一种同时特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.IDNo.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.IDNo.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。作为本专利技术的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的能力。作为本专利技术的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体4F7。所述单克隆抗体4F7重链可变区为SEQ.IDNo.3或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.IDNo.4或其简并序列编码；对ASFVP30蛋白的ELISA效价为1∶2048000，具有良好的反应性，还可用于免疫组化对不同组织的检测。作为本专利技术的一种实施方式，所述单链抗体4F7的重链可变区为SEQ.IDNo.3所示序列或其简并序列编码，其轻链可变区为SEQ.IDNo.4所示序列或其简并序列编码。该单链抗体4F7对ASFVP30蛋白的ELISA效价为1∶819200，表明其与ASFVP30蛋白具有良好的反应特性。本专利技术涉及一种杂交瘤细胞1B11株，所述杂交瘤细胞1B11株分泌所述的单克隆抗体1B11。本专利技术涉及一种杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体1B11的可变区序列，其中，所述单克隆抗体1B11的重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体1B11的轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体1B11的可变区序列，其中，所述单克隆抗体1B11的重链可变区为SEQ.IDNo.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体1B11的轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。


2.一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.IDNo.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段的轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的能力；
更优选地，所述抗体为单克隆抗体1B11或单链抗体1B11。


3.一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体4F7的可变区序列，其中，所述单克隆抗体4F7重链可变区为SEQ.IDNo.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4F7轻链可变区为SEQ.IDNo.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。


4.一种特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.IDNo.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段的轻链可变区为SEQ.IDNo.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的能力；
更优选地，所述抗体为单克隆抗体4F7或单链抗体4F7。


5.一种杂交瘤细胞1B11株，其特征在于，所述杂交瘤细胞1B11株分泌权利要求2所述的单克隆抗体1B11。


6.一种杂交瘤细胞4F7株，其特征在于，所述杂交瘤细胞4F7株分泌权利要求4所述的单克隆抗体4F7。


7.一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体1B11以及有效量的所述单克隆抗体4F7；以及对非洲猪瘟病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
优选地，所述试剂盒为选自ELISA检测试剂盒、酶免试纸条、胶体金检测试纸条、荧光试纸条中的一种。


8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒，所述ELISA检测试剂盒包括包被有单克隆抗体1B11的包被板、酶标单克隆抗体4F7、样品稀释液、20×浓缩洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色液、终止液；
特别地，所述单克隆抗体1B11包被量所需的稀释倍数为1∶400-1∶12800、所述酶标抗体的稀释倍数为1∶2500-1∶40000，优选地所述单克隆抗体1B11包被量的稀释倍数为1∶800-1∶6400、所述酶标抗体的稀释倍数为1∶2500-1∶20000，更优选地，固定抗体1B11包被量的稀释倍数为1∶320...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，郝丽影，邓均华，
申请(专利权)人：洛阳普泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41