一种单克隆抗体、其制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种抗猪瘟病毒E2单克隆抗体、其制备方法及用途。所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列1所示；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列2所示；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列3所示；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列4所示；轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列5所示；轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列6所示。本发明专利技术所述的单克隆抗体能特异性与猪瘟病毒E2蛋白结合，具有很好的抗原结合活性和一定的病毒中和活性，既可用于猪瘟的检测诊断又可以用于预防治疗，在开发猪瘟病毒新型诊断试剂和治疗药物中具有较好的生产应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种单克隆抗体、其制备方法及用途
本专利技术属于免疫学、分子生物学领域，涉及一种抗猪瘟病毒E2的单克隆抗体、其制备方法及用途。
技术介绍
猪瘟(ClassicalSwinefever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFvirus,CSFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，其特征为发病急、高热稽留和细小血管变性，引发全身泛发型小点出血，脾梗死。不同品种、性别、年龄的猪均易感，猪瘟是严重危害养猪业的重大传染病。猪瘟的病原体猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属，同属的成员还包括牛病毒性腹泻病毒、羊边界病病毒等。猪瘟病毒基因组是长度约12.3kb的单股正链RNA，包含两端的非编码区(untranslatedregion,UTR)和中间一个大的开放阅读框(openreadingframe,ORF)，ORF编码一个大的多聚蛋白，该多聚蛋白经宿主细胞和病毒编码的蛋白酶水解加工产生具有功能的成熟蛋白，包括4种结构蛋白(Core、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中，结构蛋白E2是最主要的免疫原性蛋白，诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击，也是猪瘟基因工程疫苗研发的重要靶蛋白。我国对猪瘟防控非常重视，2017年3月21日，农业农村部印发《国家猪瘟防治指导意见(2017-2020年)》，对猪场猪瘟的净化提出明确要求，截止2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围。免疫接种是预防和控制猪瘟发生和流行的主要措施，猪瘟疫苗质量的好坏直接影响猪瘟的免疫效果。目前，市场化的猪瘟疫苗主要有三类：一是传统的猪瘟兔化弱毒活疫苗；二是基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2的昆虫细胞-杆状病毒真核系统表达的亚单位疫苗，包括国内新疆天康的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(Rb-03株)、国外CSFE2和Pesti；三是以BVDV为骨架替换相应核苷酸区域为猪瘟病毒E2基因的重组活病毒载体疫苗CP7_E2alf，包括辉瑞CP7_E2alfpilotvaccine和硕腾SuvaxynCSFMarker两个产品。基于现有的商品化猪瘟疫苗种类和生产工艺，活病毒和/或活疫苗的抗原含量定量，即猪瘟疫苗的效力检验方法——半数荧光抗体感染剂量(50％fluorescentantibodyinfectivedoes,FAID50)是病毒学领域活病毒效价测定的经典方法，具有测定结果准确、方法稳定、操作简单等特点，可以通过猪瘟病毒E2单克隆抗体利用间接或直接免疫荧光的方法测定猪瘟病毒活病毒的含量。配套猪瘟E2亚单位疫苗和重组活病毒载体疫苗CP7_E2alf的血清学鉴别诊断需要同时具有抗猪瘟病毒Erns和E2单克隆抗体，以区别出疫苗免疫动物，淘汰野毒感染动物。此外，以高特异性和亲和力为基础的猪瘟病毒E2单克隆抗体是阻断ELISA试剂盒的开发的核心。同时，野毒感染动物的治疗对抗猪瘟病毒E2单克隆抗体中和活性具有较高的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种特异性结合猪瘟病毒E2的单克隆抗体，具有高亲和力和较好特异性的特点。本专利技术的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。本专利技术的目的之三在于提供编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及插入这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的重组载体和重组细胞。本专利技术的目的之四在于提供上述单克隆抗体的制备方法和用途。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供了一种特异性结合猪瘟病毒E2的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成，重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成，即重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；重链CDR1具有序列1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链CDR2具有序列2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链CDR3具有序列3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链CDR1具有序列4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链CDR2具有序列5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链CDR3具有序列6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，重链CDR1具有序列1所示的氨基酸序列；重链CDR2具有序列2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有序列3所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有序列4所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有序列5所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有序列6所示的氨基酸序列。进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有序列7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有序列8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有序列7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有序列8所示的氨基酸序列。包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本专利技术的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本专利技术的单克隆抗体结合性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。本专利技术的单克隆抗体还包括猪源与非猪源抗体，以及具有与上述单克隆抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。进一步，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。Fab′是指包含了部分铰链区的Fab片段。F(ab′)2是指Fab′的二聚体。Fv是指含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。单链抗体是指由轻链可变区和重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。本专利技术公开的单克隆抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强抗体的免疫原性。本专利技术的单克隆抗体可以被设计为在Fc区域内包含修饰，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本专利技术的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。本专利技术还提供了编码前面所述的单克隆或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列，或编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成，重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成，其特征在于：重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列1所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列2所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列3所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列4所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列5所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列6所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；/n所述抗原结合片段选自Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，Fab/c，单链抗体或双价抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区均由决定簇互补区和框架区组成，重链可变区和轻链可变区的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成，其特征在于：重链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列1所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列2所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；重链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列3所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如序列4所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如序列5所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如序列6所示或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；
所述抗原结合片段选自Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，Fab/c，单链抗体或双价抗体。


2.根据权利要求1所述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体包括：
1)重链可变区，其由下述序列组成：
序列7所示的氨基酸序列，或与序列7所示的序列具有大于等于93％-小于100％序列同一性的序列；
2)轻链可变区，其由下述序列组成：
序列8所示的氨基酸序列，或与序列8所示的序列具有大于等于93％-小于100％序列同一性的序列。


3.编码权利要求1或2所述的抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
优选的，编码重链可变区的CDR1的核酸分子序列如序列11所示，编码重链可变区的CDR2的核酸分子序列如序列12所示，编码重链可变区的CDR3的核酸分子序列如序列13所示，编码轻链可变区的CDR1的核酸分子序列如序列14所示，编码轻链可变区的CDR2的核酸分子序列如序列15所示，编码轻链可变区的CDR3的核酸分子序列如序列16所示；
更优选的，所述抗猪瘟病毒E2单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区编码的核酸分子如序列9所示，轻链可变区编码的核酸分子如序列10所示。


4.一种重组载体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲，董春娜，吴冬荀，张艳宾，张蕾，张彤，李静，刘新月，肖进，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11