猫细小病毒抗体序列、四肽链分子、球蛋白分子及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒抗体技术领域，公开了一种猫细小病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用，序列为重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。序列的筛选方法包括：噬菌体抗体的制备；噬菌体抗体文库的淘筛；PhageELISA方法鉴定抗猫细小病毒猫源噬菌体单链抗体；将PhageELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。本发明专利技术为构建高亲和力、低免疫原性的犬源化抗猫细小病毒的基因工程抗体提供支持。对推动猫源化抗体药物的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
猫细小病毒抗体序列、四肽链分子、球蛋白分子及应用
本专利技术属于病毒抗体
，尤其涉及一种猫细小病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。
技术介绍
目前，猫细小病毒(Felinepanleukopeniavirus)，在临床上该病毒主要表现出上吐下泻、肠炎、发高烧等症状，可造成白细胞数量剧烈下降，能够通过呼吸道、消化道或者直接接触等方式传染。目前，关于猫细小病毒仍以预防为主，尚无特效的治疗药物，多采用对症治疗、支持疗法等。目前对于猫细小病毒病临床治疗主要依赖于单克隆抗体，市售抗体多为异种动物免疫血清，虽然能保护幼龄动物和成年动物免受感染，但无法连续注射，否则将造成剧烈的过敏反应，严重时可导致动物死亡。另外，传统鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果。目前，噬菌体展示技术有着越来越广泛的应用，更多的本动物源化的噬菌体展示抗体库成功构建，尤其是一些单抗药物的研发，使噬菌体展示技术得到了更好地发展。目前，大多构建的为免疫噬菌体库，因为通过免疫后动物体内的抗体水平提高，更有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果会更有优势。目前，大多数均为单克隆抗体，而针对猫源的噬菌体抗体库避免了抗体使用过程中的干扰因素，为猫细小病毒的诊断和治疗单抗的制备提供了理论依据。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前，并未有人构建过针对猫源的噬菌体抗体库。解决以上问题及缺陷的难度为：要想得到一定规模的抗体库，首先要做的是借助RT-PCR技术，获取机体本源的全套抗体基因，目前关于猫源基因序列报道较少，需要我们对抗体轻、重链可变区序列进行多对引物验证。解决以上问题及缺陷的意义为：有利于筛选到针对特异性抗原的抗体，对后续诊断及治疗效果会更有优势。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种猫细小病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。本专利技术是这样实现的，一种猫细小病毒抗体序列，所述猫细小病毒抗体序列为重链可变区氨基酸序列SEQIDNO：1和核苷酸序列SEQIDNO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO：2和核苷酸序列SEQIDNO：4。本专利技术的另一目的在于提供一种由所述猫细小病毒抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成一个四肽链分子。本专利技术的另一目的在于提供一种包含所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。本专利技术的另一目的在于提供一种猫细小病毒的检测方法，所述猫细小病毒的检测方法使用所述的猫细小病毒抗体序列。本专利技术的另一目的在于提供一种治疗猫细小病毒单抗的制备方法，所述治疗猫细小病毒单抗的制备方法使用所述的猫细小病毒抗体序列。本专利技术的另一目的在于提供一种所述猫细小病毒抗体序列的筛选方法，所述猫细小病毒抗体序列的筛选方法包括：第一步，噬菌体抗体的制备；第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；第三步，PhageELISA方法鉴定抗猫细小病毒猫源噬菌体单链抗体；第四步，将PhageELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。进一步，所述第一步包括：将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mLOD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG，220rpm/min，37℃，摇菌6h，将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清，以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜，12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。进一步，所述第二步包括：(1)包被：用0.1MNaHCO3将纯化后的猫细小病毒稀释成2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜，包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；(3)洗涤：每孔加入100μLPBST，共洗涤3次，每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；(5)洗涤：重复步骤(3)；(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min，每400μL洗脱液加入75μLTris-HCL进行中和，将20μL此液体加入到180μLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量，并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mLLB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖，待菌液OD600＝0.5时加入4×1010辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清，以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜。12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量，并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。进一步，所述第三步包括：(1)包被：将纯化后猫细小病毒用0.1MNaHCO3稀释成8μg/mL包被96孔酶标板，将BSA设为空白对照，M13K07为阴性对照；...

【技术保护点】
1.一种猫细小病毒抗体序列，其特征在于，所述猫细小病毒抗体序列为重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。/n

【技术特征摘要】
1.一种猫细小病毒抗体序列，其特征在于，所述猫细小病毒抗体序列为重链可变区氨基酸序列SEQIDNO：1和核苷酸序列SEQIDNO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO：2和核苷酸序列SEQIDNO：4。


2.一种由权利要求1所述猫细小病毒抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成一个四肽链分子。


3.一种包含权利要求2所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。


4.一种猫细小病毒的检测方法，其特征在于，所述猫细小病毒的检测方法使用权利要求1所述的猫细小病毒抗体序列。


5.一种治疗猫细小病毒单抗的制备方法，其特征在于，所述治疗猫细小病毒单抗的制备方法使用权利要求1所述的猫细小病毒抗体序列。


6.一种如权利要求1所述猫细小病毒抗体序列的筛选方法，其特征在于，所述猫细小病毒抗体序列的筛选方法包括：
第一步，噬菌体抗体的制备；
第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；
第三步，PhageELISA方法鉴定抗猫细小病毒猫源噬菌体单链抗体；
第四步，将PhageELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫细小病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。


7.如权利要求6所述的猫细小病毒抗体序列的筛选方法，其特征在于，所述第一步包括：将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mLOD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG，220rpm/min，37℃，摇菌6h，将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清，以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜，12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。


8.如权利要求6所述的猫细小病毒抗体序列的筛选方法，其特征在于，所述第二步包括：
(1)包被：用0.1MNaHCO3将纯化后的猫细小病毒稀释成2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜，包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；
(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；
(3)洗涤：每孔加入100μLPBST，共洗涤3次，每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；
(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；
(5)洗涤：重复步骤(3)；
(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min，每400μL洗脱液加入75μLTris-HCL进行中和，将20μL此液体加入到180μLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量，并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；
(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mLLB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖，待菌液OD600＝0.5时加入4×1010辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清，以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜，12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；
(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量，并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。


9.如权利要求6所述的猫细小病毒抗体序列的筛选方法，其特征在于，所述第三步包括：
(1)包被：...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲雪婷，尹燕博，
申请(专利权)人：青岛博隆基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37