猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子制造技术

本发明专利技术属于病毒抗体技术领域，公开了一种猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用，序列为：重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。病毒抗体序列的筛选方法包括：噬菌体抗体的制备；噬菌体抗体文库的淘筛；Phage ELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体；将Phage ELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到重链、轻链可变区序列。本发明专利技术为构建高亲和力、低免疫原性的猫源化抗猫杯状病毒的基因工程抗体提供支持，对推动猫源化抗体药物的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子
本专利技术属于病毒抗体
，尤其涉及一种猫杯状病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子及应用。
技术介绍
目前，猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)是一种于杯状病毒，能对人等多种动物进行感染。临床表现是溃疡的有鼻孔、口腔，皮肤水肿、重症的肺炎等；慢性病例的临床表现为鼻孔、上颚呈现出损伤，低热，口腔、眼角的分泌物明显增加，该病毒当前的分布呈世界性。目前对于猫杯状病毒病临床治疗主要依赖于单克隆抗体，市售抗体多为异种动物免疫血清，虽然能保护幼龄动物和成年动物免受感染，但无法连续注射，否则将造成剧烈的过敏反应，严重时可导致动物死亡。另外，传统鼠源单克隆抗体对非鼠源体有较强的异源性和免疫原性，在体内应用时容易引起宿主的免疫排斥或过敏反应，使得鼠源单克隆抗体疗效降低，甚至在病体内产生严重后果,极大地限制了鼠源单克隆抗体的临床应用的效果。目前，噬菌体展示技术有着越来越广泛的应用，更多的本动物源化的噬菌体展示抗体库成功构建，尤其是一些单抗药物的研发，使噬菌体展示技术得到了更好地发展本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猫杯状病毒抗体序列，其特征在于，所述病毒抗体序列为：重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2和核苷酸序列SEQ ID NO：4。/n

【技术特征摘要】
1.一种猫杯状病毒抗体序列，其特征在于，所述病毒抗体序列为：重链可变区氨基酸序列SEQIDNO：1和核苷酸序列SEQIDNO：3；轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO：2和核苷酸序列SEQIDNO：4。


2.一种由权利要求1所述病毒抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成一个四肽链分子。


3.一种包含权利要求2所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。


4.一种猫杯状病毒的检测方法，其特征在于，所述猫杯状病毒的检测方法使用权利要求1所述的病毒抗体序列。


5.一种治疗猫杯状病毒单抗的制备方法，其特征在于，所述治疗猫杯状病毒单抗的制备方法使用权利要求1所述的病毒抗体序列。


6.一种如权利要求1所述病毒抗体序列的筛选方法，其特征在于，所述病毒抗体序列对的筛选方法包括以下步骤：
第一步，噬菌体抗体的制备；
第二步，噬菌体抗体文库的淘筛；
第三步，PhageELISA方法鉴定抗猫杯状病毒猫源噬菌体单链抗体；
第四步，将PhageELISA鉴定结果为阳性的scFv菌液送测序公司测序，得到猫源化的抗猫杯状病毒的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。


7.如权利要求6所述的病毒抗体序列对的筛选方法，其特征在于，所述第一步包括：将1mL的噬菌体初级抗体库加入到3mLOD600＝0.5的XLI-Blue菌液，37℃放置45min，加入6mL含Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基，并按1:1000加入葡萄糖1mol/L继续培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，放置37℃温箱感染30min后，220rpm/min，37℃培养1h，将菌液3500rpm离心10min，弃上清，用等体积含有Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基，以1:1000加入IPTG(1mol/L)，220rpm/min，37℃，摇菌6h；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清；以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，计算输入淘筛的噬菌体量后，待淘选。


8.如权利要求6所述的病毒抗体序列对的筛选方法，其特征在于，所述第二步包括：
(1)包被：用0.1MNaHCO3将纯化后的猫杯状病毒稀释成2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的不同浓度包被96孔酶标板，每孔100μL，放置4℃冰箱过夜，包被完毕后，将96孔酶标板内液体弃掉，每孔加入100μL洗涤缓冲液PBST，清洗3遍；
(2)封闭：每孔加入250μL的封闭液，放入37℃温箱2h进行封闭；
(3)洗涤：每孔加入100μLPBST，共洗涤3次，每次洗涤，用摇板仪以400rpm摇1min，并将酶标板竖立转动一圈，浸润管壁；
(4)加入噬菌体抗体：每孔100μL加入噬菌体抗体，先用摇板仪400rpm/min摇5min，室温孵育1h；
(5)洗涤：重复步骤(3)；
(6)洗脱：每孔50μL加入终止液，摇板仪以1000rpm摇5min，每400μL洗脱液加入75μLTris-HCL进行中和；将20μL此液体加入到180μLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染20min，将20μL菌液涂在含Amp+(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，计算输出的噬菌体库量，并挑取单克隆菌落摇菌，进行PCR鉴定，并送测序；
(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90％，加入3mLOD600＝0.5的感受态细胞中，感染30min后，加入6mLLB液体，并加入终浓度为100μg/mL的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖；待菌液OD600＝0.5时加入4×1010辅助噬菌体M13K07，静置孵育30min后，以220rpm/min振荡培养1h，3500rpm/min离心6min，弃去上清，用等体积含Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)的LB液体培养基重悬沉淀，37℃，220rpm/min振荡培养过夜；将培养基12000rpm，离心10-20min，收集上清，以1:4-1:5加入PEG8000，颠倒混匀，此时会出现云雾状沉淀，至4℃冰箱过夜；12000rpm离心10min后收集沉淀，用1.5mL1×PBS重悬沉淀，按1:4-1:5的比例再次加入PEG8000，颠倒均匀，至4℃冰箱2-3h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用300μL1×PBS重悬沉淀，得到第一轮单链抗体文库；
(8)进行3-4轮噬菌体淘筛，并每次计算输入及输出的噬菌体库量；并将最后一轮噬菌体库加入50％甘油储存在-80℃冰箱。


9.如权利要求6所述的病毒抗体序列对的筛选方法，其特征在于，所述第三步包括：
(1)包被...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲雪婷，尹燕博，
申请(专利权)人：青岛博隆基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37