一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法技术

技术编号:26300033 阅读:47 留言:0更新日期:2020-11-10 19:48
本发明专利技术公开了一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。该方法包括:固定细胞或组织中蛋白质介导的RNA相互作用;在保持细胞完整的情况下行膜穿孔;降解游离RNA;在RNA3’末端行pCp‑biotin标记并原位近端连接;细胞消解后纯化含C‑biotin的嵌合体RNA;构建链特异性文库;高通量测序。本发明专利技术在不破坏细胞结构、保持细胞完整的情况下,原位处理胞内RNA,捕获生理状态下RNA分子内(间)相互作用;用pCp‑biotin标记RNA末端,非变性条件下原位连接,极大提高标记效率,同时降低分子间非特异连接;用C1磁珠能高效富集标记C‑biotin的嵌合体RNA,增加测序有效数据比例,降低测序成本。

【技术实现步骤摘要】
一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。
技术介绍
遗传信息的载体DNA需要先转录成RNA,然后再翻译成蛋白质才能发挥生物学功能。RNA作为遗传信息的传递者,主要作用是编码和指导蛋白质的合成,这一类编码蛋白质的RNA统称为信使RNA(messengerRNA,mRNA)。此外,人类基因组还转录产生了海量的不编码蛋白质的RNA,这类RNA被称为非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)。目前已发现的具有调控作用的非编码RNA包括:tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、circRNA和lncRNA等,它们的异常表达和突变与癌症发生、发育和生殖缺陷等重大疾病相关。作为遗传信息的关键调控者,RNA往往需要先通过分子内碱基配对形成复杂的高级结构,然后再通过与其他的RNA分子相互作用才能发挥重要的生物学调控功能。利用测序技术,我们已经可以获得RNA的详细序列信息,但是对于RNA的结构,尤其是高级结构信息的获取依然是个世界性难题。虽然一些物理手段,比如核磁共振、冷冻电镜和晶体学等方法可以解析RNA的高分辨率结构和分子内及分子间相互作用,但是这些技术的通量太低。目前国际蛋白质数据库PDB中收录的人源RNA的高分辨率结构屈指可数。因此,如何系统和精确的解析RNA的分子内和分子间相互作用依然是我们所面临的巨大挑战。近年来,大量分析RNA二级结构的技术被开发出来,这些技术的特点是先利用化学修饰或者酶切处理RNA,然后再进行建库测序,例如:DMS-seq、Structure-seq、icSHAPE等,他们利用了单链区的RNA容易被化合物DMS(dimethylsuberimidate,硫酸二甲酯)或NAI-N3等修饰的特点,通过分析反转录酶停止的位置而推导RNA的哪些碱基处于单链区。此外,对于RNA结构中的双链配对区域,目前也有多个方法可以解析,例如PARIS、LIGR-seq和SPLASH等。这三种方法的基本原理是:在培养基中加入Psoralen或AMT,它们进入细胞后会穿过细胞膜并迅速结合到RNA上双链配对的区域,经254nm的紫外线(UV)照射后,细胞内配对的RNA会被psoralen或AMT共价交联起来,之后对富集出的RNA进行片段化处理,并在溶液中进行近端连接。然后对连接后的RNA进行365nmUV照射后可打开psoralen或AMT与双链RNA之间的共价键,之后进行文库构建和测序。以上方法虽然可以高通量的研究RNA的单链区和双链区,但也存在一些缺陷:第一,不能捕获非Watson-Crick配对以及远距离的RNAloop-loop相互作用。第二,这些连接反应都是在溶液中进行,存在非特异性连接,不能反映RNA在细胞内的真实结构,导致大量的假阳性分子间连接。第三,测序所得数据中,嵌合体reads(chimericreads,即不同RNA片段间连接的产物)比率较低,无用数据太多。RNA近端连接技术(RPL)理论上可以克服以上技术缺陷,但由于缺乏交联和嵌合体RNA富集,因此导致RPL技术只能鉴定分子内相互作用,而不能鉴定分子间的RNA-RNA相互作用。近年来的高通量转录组测序表明超过90%的基因组被转录,产生了海量的非编码RNA,其中一些非编码RNA与染色质紧密结合,如lncRNA(longnon-codingRNA)。lncRNA是一类长度在200nt以上、不编码蛋白质的RNA。目前NONCODE收录的人类lncRNA数目已经超过了160000个,是蛋白质编码基因的8倍,但是绝大多数非编码RNA的功能、靶标及作用机制还不清楚。目前常用的鉴定lncRNA靶标的方法包括:CHIRP、CHART和RAP。这些方法的原理是:在生理状态下,首先利用甲醛处理细胞,以固定RNA及其相互作用的靶标分子;然后裂解细胞,利用超声或酶对染色质进行片段化;之后利用生物素修饰的DNA探针富集与目的RNA相互作用的DNA片段;对DNA片段加接头后,利用PCR进行文库扩增和高通量测序;最后结合生物信息学分析,鉴定与特定lncRNA相互作用的靶标DNA。CHIRP、CHART和RAP方法只关注DNA靶标,忽略了具有重要功能的RNA靶位点,而且每次只能鉴定一个lncRNA在细胞内的所有潜在的DNA靶标(onetoall),通量太低。因此,如何系统鉴定细胞内所有lncRNA在基因组上的所有结合位点还是个难题。
技术实现思路
鉴于以上技术存在的问题,本专利技术开发了RNA原位构象测序新技术(RNAinsituconformationsequencing,简称RIC-seq)。基本原理是对细胞进行甲醛交联以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用,并在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔,进而利用微球菌核酸酶切割以去除游离的不受蛋白质保护的片段,然后在RNA的3’末端上进行pCp-biotin标记并在原位进行近端连接。细胞消解后纯化含有C-biotin的嵌合体RNA,并进行链特异性文库构建,该步骤大大提高了数据中嵌合体reads的比率,减少了无用数据,降低了测序成本。RIC-seq在保持细胞完整性的条件下进行RNA-RNA的原位连接,可一次性捕获所有直接的RNA-RNA近距离接触,并可在原位检测所有的lncRNA在体内的RNA结合靶标(alltoall)。最重要的是可根据RNA的近端空间距离信息重构RNA的高级结构。第一方面,本专利技术要求保护一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法(即RIC-seq法)。本专利技术所要求保护的原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法(RIC-seq法),可包括如下步骤:(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用。其中,所述组织样本的体积大小可为1立方毫米;所述近距离可为距离50埃以内。(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔(细胞膜和核膜穿孔)。(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA。(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接。其中,所述近端可为距离50埃以内。其中,所述“pCp-标记物1”为两端为磷酸基团且标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸。相应的,后文出现的“Cp-标记物”为3’末端为磷酸基因且标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸;“C-标记物1”为标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸。在本专利技术的具体实施例方式中,所述“pCp-标记物1”具体为pCp-biotin。相应的,所述“Cp-标记物1”具体为Cp-biotin;所述“C-标记物1”具体为C-biotin。所述pCp-biotin为两端为磷酸基团且标记有生物素的胞嘧啶核苷酸。相应的,后文出现的Cp-biotin为3’末端为磷酸基因且标记有生物素的胞嘧啶核苷酸;C-biotin为标记有生物素的胞嘧啶核苷酸。(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA(chimeric本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法,包括如下步骤:/n(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用;/n(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔;/n(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA;/n(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接;/n(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA;进行链特异性文库构建;/n(6)进行高通量测序。/n

【技术特征摘要】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法,包括如下步骤:
(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用;
(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔;
(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA;
(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接;
(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA;进行链特异性文库构建;
(6)进行高通量测序。


2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述对细胞或组织样本进行处理为对细胞或组织样本进行甲醛交联;
进一步地,所述步骤(1)是按照包括如下步骤的方法进行的:
(a1)将所述细胞或组织样本置于甲醛溶液中,室温放置10分钟;
进一步地,所述甲醛溶液为体积百分比为1%的甲醛溶液;
更进一步地,在步骤(a1)之后还包括如下步骤(a2):
(a2)向步骤(a1)处理过的细胞或组织样本中加入甘氨酸溶液,放置10分钟;
进一步地,所述甘氨酸溶液为浓度为0.125mol/L的甘氨酸溶液。


3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(2)中,进行所述膜穿孔时采用的穿孔液为Permeabilization溶液;
进一步地,所述步骤(2)是按照包括如下步骤的方法进行的:
(b1)将经步骤(1)处理过的细胞或组织样本置于所述Permeabilization溶液中,0-4℃放置15分钟;其中,所述Permeabilization溶液的溶剂为10mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液,溶质及浓度如下:10mMNaCl,0.5%NP-40,0.3%TritonX-100,0.1%Tween20,1×proteaseinhibitors和2U/mlSUPERase·InTMRNaseInhibitor;%均表示体积百分含量;
更进一步地,在步骤(b1)之后还包括如下步骤(b2):
(b2)将步骤(b1)处理过的细胞或组织样本用1×PNK溶液洗涤;其中,所述1×PNK溶液的溶剂为50mMpH7.4的Tris-Cl缓冲液,溶剂及浓度如下:10mMMgCl2,0.1mg/mlBSA,0.2%NP-40;%表示体积百分含量。


4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,是采用微球菌核酸酶来实现所述“降解游离的...

【专利技术属性】
技术研发人员:薛愿超蔡兆奎曹唱唱
申请(专利权)人:中国科学院生物物理研究所
类型:发明
国别省市:北京;11

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1