【技术实现步骤摘要】
一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。
技术介绍
遗传信息的载体DNA需要先转录成RNA，然后再翻译成蛋白质才能发挥生物学功能。RNA作为遗传信息的传递者，主要作用是编码和指导蛋白质的合成，这一类编码蛋白质的RNA统称为信使RNA(messengerRNA,mRNA)。此外，人类基因组还转录产生了海量的不编码蛋白质的RNA，这类RNA被称为非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)。目前已发现的具有调控作用的非编码RNA包括：tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、circRNA和lncRNA等，它们的异常表达和突变与癌症发生、发育和生殖缺陷等重大疾病相关。作为遗传信息的关键调控者，RNA往往需要先通过分子内碱基配对形成复杂的高级结构，然后再通过与其他的RNA分子相互作用才能发挥重要的生物学调控功能。利用测序技术，我们已经可以获得RNA的详细序列信息，但是对于RNA的结构，尤其是高级结构信息的获取依然...
【技术保护点】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：/n(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用；/n(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔；/n(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA；/n(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接；/n(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA；进行链特异性文库构建；/n(6)进行高通量测序。/n
【技术特征摘要】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：
(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用；
(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔；
(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA；
(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接；
(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA；进行链特异性文库构建；
(6)进行高通量测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述对细胞或组织样本进行处理为对细胞或组织样本进行甲醛交联；
进一步地，所述步骤(1)是按照包括如下步骤的方法进行的：
(a1)将所述细胞或组织样本置于甲醛溶液中，室温放置10分钟；
进一步地，所述甲醛溶液为体积百分比为1％的甲醛溶液；
更进一步地，在步骤(a1)之后还包括如下步骤(a2)：
(a2)向步骤(a1)处理过的细胞或组织样本中加入甘氨酸溶液，放置10分钟；
进一步地，所述甘氨酸溶液为浓度为0.125mol/L的甘氨酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行所述膜穿孔时采用的穿孔液为Permeabilization溶液；
进一步地，所述步骤(2)是按照包括如下步骤的方法进行的：
(b1)将经步骤(1)处理过的细胞或组织样本置于所述Permeabilization溶液中，0-4℃放置15分钟；其中，所述Permeabilization溶液的溶剂为10mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度如下：10mMNaCl，0.5％NP-40，0.3％TritonX-100，0.1％Tween20，1×proteaseinhibitors和2U/mlSUPERase·InTMRNaseInhibitor；％均表示体积百分含量；
更进一步地，在步骤(b1)之后还包括如下步骤(b2)：
(b2)将步骤(b1)处理过的细胞或组织样本用1×PNK溶液洗涤；其中，所述1×PNK溶液的溶剂为50mMpH7.4的Tris-Cl缓冲液，溶剂及浓度如下：10mMMgCl2，0.1mg/mlBSA，0.2％NP-40；％表示体积百分含量。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，是采用微球菌核酸酶来实现所述“降解游离的...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛愿超，蔡兆奎，曹唱唱，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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