一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法技术

本发明专利技术公开了一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。该方法包括：固定细胞或组织中蛋白质介导的RNA相互作用；在保持细胞完整的情况下行膜穿孔；降解游离RNA；在RNA3’末端行pCp‑biotin标记并原位近端连接；细胞消解后纯化含C‑biotin的嵌合体RNA；构建链特异性文库；高通量测序。本发明专利技术在不破坏细胞结构、保持细胞完整的情况下，原位处理胞内RNA，捕获生理状态下RNA分子内(间)相互作用；用pCp‑biotin标记RNA末端，非变性条件下原位连接，极大提高标记效率，同时降低分子间非特异连接；用C1磁珠能高效富集标记C‑biotin的嵌合体RNA，增加测序有效数据比例，降低测序成本。

【技术实现步骤摘要】
一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种捕获RNA原位高级结构及相互作用的方法。
技术介绍
遗传信息的载体DNA需要先转录成RNA，然后再翻译成蛋白质才能发挥生物学功能。RNA作为遗传信息的传递者，主要作用是编码和指导蛋白质的合成，这一类编码蛋白质的RNA统称为信使RNA(messengerRNA,mRNA)。此外，人类基因组还转录产生了海量的不编码蛋白质的RNA，这类RNA被称为非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)。目前已发现的具有调控作用的非编码RNA包括：tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、circRNA和lncRNA等，它们的异常表达和突变与癌症发生、发育和生殖缺陷等重大疾病相关。作为遗传信息的关键调控者，RNA往往需要先通过分子内碱基配对形成复杂的高级结构，然后再通过与其他的RNA分子相互作用才能发挥重要的生物学调控功能。利用测序技术，我们已经可以获得RNA的详细序列信息，但是对于RNA的结构，尤其是高级结构信息的获取依然是个世界性难题。虽然一些物理手段，比如核磁共振、冷冻电镜和晶体学等方法可以解析RNA的高分辨率结构和分子内及分子间相互作用，但是这些技术的通量太低。目前国际蛋白质数据库PDB中收录的人源RNA的高分辨率结构屈指可数。因此，如何系统和精确的解析RNA的分子内和分子间相互作用依然是我们所面临的巨大挑战。近年来，大量分析RNA二级结构的技术被开发出来，这些技术的特点是先利用化学修饰或者酶切处理RNA，然后再进行建库测序，例如：DMS-seq、Structure-seq、icSHAPE等，他们利用了单链区的RNA容易被化合物DMS(dimethylsuberimidate，硫酸二甲酯)或NAI-N3等修饰的特点，通过分析反转录酶停止的位置而推导RNA的哪些碱基处于单链区。此外，对于RNA结构中的双链配对区域，目前也有多个方法可以解析，例如PARIS、LIGR-seq和SPLASH等。这三种方法的基本原理是：在培养基中加入Psoralen或AMT，它们进入细胞后会穿过细胞膜并迅速结合到RNA上双链配对的区域，经254nm的紫外线(UV)照射后，细胞内配对的RNA会被psoralen或AMT共价交联起来，之后对富集出的RNA进行片段化处理，并在溶液中进行近端连接。然后对连接后的RNA进行365nmUV照射后可打开psoralen或AMT与双链RNA之间的共价键，之后进行文库构建和测序。以上方法虽然可以高通量的研究RNA的单链区和双链区，但也存在一些缺陷：第一，不能捕获非Watson-Crick配对以及远距离的RNAloop-loop相互作用。第二，这些连接反应都是在溶液中进行，存在非特异性连接，不能反映RNA在细胞内的真实结构，导致大量的假阳性分子间连接。第三，测序所得数据中，嵌合体reads(chimericreads,即不同RNA片段间连接的产物)比率较低，无用数据太多。RNA近端连接技术(RPL)理论上可以克服以上技术缺陷，但由于缺乏交联和嵌合体RNA富集，因此导致RPL技术只能鉴定分子内相互作用，而不能鉴定分子间的RNA-RNA相互作用。近年来的高通量转录组测序表明超过90％的基因组被转录，产生了海量的非编码RNA，其中一些非编码RNA与染色质紧密结合，如lncRNA(longnon-codingRNA)。lncRNA是一类长度在200nt以上、不编码蛋白质的RNA。目前NONCODE收录的人类lncRNA数目已经超过了160000个，是蛋白质编码基因的8倍，但是绝大多数非编码RNA的功能、靶标及作用机制还不清楚。目前常用的鉴定lncRNA靶标的方法包括：CHIRP、CHART和RAP。这些方法的原理是：在生理状态下，首先利用甲醛处理细胞，以固定RNA及其相互作用的靶标分子；然后裂解细胞，利用超声或酶对染色质进行片段化；之后利用生物素修饰的DNA探针富集与目的RNA相互作用的DNA片段；对DNA片段加接头后，利用PCR进行文库扩增和高通量测序；最后结合生物信息学分析，鉴定与特定lncRNA相互作用的靶标DNA。CHIRP、CHART和RAP方法只关注DNA靶标，忽略了具有重要功能的RNA靶位点，而且每次只能鉴定一个lncRNA在细胞内的所有潜在的DNA靶标(onetoall)，通量太低。因此，如何系统鉴定细胞内所有lncRNA在基因组上的所有结合位点还是个难题。
技术实现思路
鉴于以上技术存在的问题，本专利技术开发了RNA原位构象测序新技术(RNAinsituconformationsequencing,简称RIC-seq)。基本原理是对细胞进行甲醛交联以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用，并在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔，进而利用微球菌核酸酶切割以去除游离的不受蛋白质保护的片段，然后在RNA的3’末端上进行pCp-biotin标记并在原位进行近端连接。细胞消解后纯化含有C-biotin的嵌合体RNA，并进行链特异性文库构建，该步骤大大提高了数据中嵌合体reads的比率，减少了无用数据，降低了测序成本。RIC-seq在保持细胞完整性的条件下进行RNA-RNA的原位连接，可一次性捕获所有直接的RNA-RNA近距离接触，并可在原位检测所有的lncRNA在体内的RNA结合靶标(alltoall)。最重要的是可根据RNA的近端空间距离信息重构RNA的高级结构。第一方面，本专利技术要求保护一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法(即RIC-seq法)。本专利技术所要求保护的原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法(RIC-seq法)，可包括如下步骤：(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用。其中，所述组织样本的体积大小可为1立方毫米；所述近距离可为距离50埃以内。(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔(细胞膜和核膜穿孔)。(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA。(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接。其中，所述近端可为距离50埃以内。其中，所述“pCp-标记物1”为两端为磷酸基团且标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸。相应的，后文出现的“Cp-标记物”为3’末端为磷酸基因且标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸；“C-标记物1”为标记有所述标记物1的胞嘧啶核苷酸。在本专利技术的具体实施例方式中，所述“pCp-标记物1”具体为pCp-biotin。相应的，所述“Cp-标记物1”具体为Cp-biotin；所述“C-标记物1”具体为C-biotin。所述pCp-biotin为两端为磷酸基团且标记有生物素的胞嘧啶核苷酸。相应的，后文出现的Cp-biotin为3’末端为磷酸基因且标记有生物素的胞嘧啶核苷酸；C-biotin为标记有生物素的胞嘧啶核苷酸。(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA(chimeric本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：/n(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用；/n(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔；/n(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA；/n(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接；/n(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA；进行链特异性文库构建；/n(6)进行高通量测序。/n

【技术特征摘要】
1.一种原位捕获RNA高级结构和/或鉴定原位RNA-RNA相互作用的方法，包括如下步骤：
(1)对细胞或组织样本进行处理以固定蛋白质介导的RNA-RNA近距离相互作用；
(2)在保持细胞完整的情况下进行膜穿孔；
(3)降解游离的不受蛋白质保护的RNA；
(4)在受蛋白质保护的RNA的3’末端进行“pCp-标记物1”标记并在原位进行近端连接；
(5)细胞消解后纯化含有“C-标记物1”的嵌合体RNA；进行链特异性文库构建；
(6)进行高通量测序。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述对细胞或组织样本进行处理为对细胞或组织样本进行甲醛交联；
进一步地，所述步骤(1)是按照包括如下步骤的方法进行的：
(a1)将所述细胞或组织样本置于甲醛溶液中，室温放置10分钟；
进一步地，所述甲醛溶液为体积百分比为1％的甲醛溶液；
更进一步地，在步骤(a1)之后还包括如下步骤(a2)：
(a2)向步骤(a1)处理过的细胞或组织样本中加入甘氨酸溶液，放置10分钟；
进一步地，所述甘氨酸溶液为浓度为0.125mol/L的甘氨酸溶液。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行所述膜穿孔时采用的穿孔液为Permeabilization溶液；
进一步地，所述步骤(2)是按照包括如下步骤的方法进行的：
(b1)将经步骤(1)处理过的细胞或组织样本置于所述Permeabilization溶液中，0-4℃放置15分钟；其中，所述Permeabilization溶液的溶剂为10mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度如下：10mMNaCl，0.5％NP-40，0.3％TritonX-100，0.1％Tween20，1×proteaseinhibitors和2U/mlSUPERase·InTMRNaseInhibitor；％均表示体积百分含量；
更进一步地，在步骤(b1)之后还包括如下步骤(b2)：
(b2)将步骤(b1)处理过的细胞或组织样本用1×PNK溶液洗涤；其中，所述1×PNK溶液的溶剂为50mMpH7.4的Tris-Cl缓冲液，溶剂及浓度如下：10mMMgCl2，0.1mg/mlBSA，0.2％NP-40；％表示体积百分含量。


4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，是采用微球菌核酸酶来实现所述“降解游离的...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛愿超，蔡兆奎，曹唱唱，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11