同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，通过在外周血单个核细胞(PBMC)中加入新生抗原多肽，获取经抗原刺激的细胞，与传统方法比，减少了获取抗原特异性细胞所需的时间，验证新生抗原免疫原性及获得TCR CDR3序列的整个过程仅需13天，与传统方法长达40天的处理过程相比，大大节省了时间成本。与传统的MHC‑肽四聚体技术相比，费用低廉，MHC‑肽四聚体技术中一条抗原多肽需要制备一种专门的四聚体，而本发明专利技术所述的测序方法，成本得到了显著降低，与传统的ELISPOT方法其测试通量仅能达到10条/批次相比，本发明专利技术采用的测序方法测试通量不受限，效率更高，且测试结果准确度高、适用性广。

【技术实现步骤摘要】
同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法
本专利技术属于分子生物学和细胞免疫学
，涉及一种确定新生抗原免疫原性的方法，具体地说，涉及一种同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法。
技术介绍
T淋巴细胞(Tlymphocyte)简称T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞能够通过T细胞抗原识别受体(Tcellreceptor,TCR)特异性识别肿瘤细胞表达之后递呈到细胞表面主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)分子上的新生抗原，产生抗原特异性T细胞，识别并杀伤肿瘤细胞，完成机体的抗肿瘤细胞免疫。肿瘤新生抗原是一种抗肿瘤免疫治疗理想的靶点，因此寻找不同类型肿瘤的新生抗原逐渐成为行业的研究热点，以开发出新的肿瘤免疫治疗方案，如开发个性化新生抗原疫苗和过继性新生抗原特异性T细胞免疫疗法等。具有免疫原性的肿瘤新生抗原能激活T细胞产生抗原特异性T细胞，发挥抗肿瘤免疫反应，所以，检测新生抗原的免疫原性成为了开发新的抗肿瘤免疫治疗方法中的重要一环，目前，常规的验证新生抗原的免疫原性的方法包括：酶联免疫斑点检测(ELISPOT)技术、MHC-肽四聚体流式分析技术和细胞内因子染色(ICS)技术。其中，ELISPOT技术与ICS技术验证新生抗原免疫原性的原理是类似的，都是通过检测T细胞在抗原的刺激下能否分泌细胞因子来验证新生抗原的免疫原性。而四聚体流式分析技术则是通过检测新生抗原是否能与TCR结合来验证新生抗原的免疫原性，此种分析技术具体是：在体外将MHC多肽复合物单体分子通过生物素-链霉亲和素的相互作用连接在基座上，四个单体连接在一个基座上形成了四聚体的结构，最多可将十二个单体连接在一起构建为十二聚体。该复合物能够识别抗原特异性T细胞的TCR，借助流式细胞仪可以将结合有MHC-抗原肽四聚体的T细胞检测和分离出来。通常，新生抗原特异性TCR通过如下方式获取：首先，用新生抗原刺激T细胞增殖，当新抗原特异性T细胞的比例上升至0.1％左右时，才能够被四聚体流式分选富集得到高纯度的新生抗原特异性T细胞，再对这些细胞进行测序，最终得到新生抗原特异性T细胞中各种TCR的序列，抗原特异性T细胞的TCR序列可应用于肿瘤诊断标记物的开发、肿瘤免疫治疗的动态监控及疗效评估。为了检测新生抗原的免疫原性，同时获知其对应的TCR序列，传统方法为：首先用新生抗原刺激T细胞，共刺激3轮，每轮刺激时间为10天，然后合成多肽制备四聚体，通过四聚体流式分选，得到新生抗原特异性T细胞，再通过测序，获得TCR的序列，上述过程需要至少30天以上。制备四聚体之前还必须知晓新生抗原多肽是有哪个分型的HLA分子提呈的，通常新生抗原多肽与HLA之间是否有亲和力是生信算法预测的结果，往往与真实情况存在一定偏差，并且，不是每一种分型的HLA分子都能被制备出来，另外，制备四聚体的成本高昂，且其容易降级，无法长时间存储，需要现配现用。因此传统MHC-肽四聚体流式分析技术存在如下技术问题：(1)预刺激时间长，新生抗原特异性T细胞在外周血单个核细胞(PBMC)中的含量低，需要用新生抗原与刺激T细胞长达30天以上的时间；(2)预刺激时需用到树突状(DC)细胞，DC细胞是从PBMC中分离的单核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的诱导下分化而成的，从单核细胞培养成为成熟的DC细胞一般需要7天，时间周期较长。还需要消耗掉一定数量的PBMC专门用于获取DC细胞；(3)四聚体制备比较困难，成本昂贵，需现配现用，不易存储；(4)实验前必须知晓多肽的HLA限制性，其次制备的MHC分子与多肽的结合具有不确定性，不能产生稳定的MHC-肽四聚体。上述问题导致传统的MHC-肽四聚体技术耗费的时间和经济成本高，不利于新生抗原免疫原性验证的规模化和标准化的实施。
技术实现思路
为此，本专利技术正是要解决上述技术问题，从而提出一种耗时短、成本低廉的可同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：本专利技术提供一种同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其包括如下步骤：S1、从外周血中分离得到外周血单个核细胞；S2、在外周血单个核细胞的培养液中加入新生抗原开始共孵育，孵育第十天收集得到预刺激细胞；S3、收集预刺激的T细胞，并提取所述T细胞的RNA，反转录成cDNA；S4、通过TCR测序得到预刺激后的T细胞的TCRCDR3序列，将测序得到的所述CDR3序列与未经抗原刺激的T细胞的测序结果比对，确定频率上升的TCR。作为优选，所述步骤S1中，共孵育第3天和第7天时，还包括更换培养液，并添加IL-2、IL-7、IL-15刺激培养的步骤。作为优选，所述步骤S1前还包括：基于非同义突变位点的抗原与相对应主要组织相容性分子的结合能力，预测得到结合能力最强的新生抗原并将所述新生抗原制备为抗原多肽的步骤。作为优选，所述结合能力最强的新生抗原包括序列为：ISFDTHLLY、VEWLGRCIL、SEIISFKSL、CSTSISNFK、SEHGFGPSL、ATSPASASK、MLICCCCTL、SYFRGSYSY、AAASATLAL、YSLPNAPTV、CWISFDTHLLY、ARPVEWLGRCILDA、LCTDVALPLIVHNIQ、EFTDLLSFIGRIR、HGFGPSLPTSGRDRL、VGLAVNSAVLYVLL、LCKMINLSKPDTI的抗原中的至少一种。作为优选，所述步骤S4所述的测序包括：将所述cDNA作为样本，利用多重PCR技术扩增样本内表达的重组的VDJ基因，然后进行测序。作为优选，所述步骤S4后还包括：S5、采用IFN-γ免疫斑点法检测TCR数量明显增高的TCR所对应的新生抗原的免疫原性。作为优选，所述步骤S5包括：S501、获取PBMC及培养成熟的DC细胞；S502、获取CD8+T细胞：将悬浮未贴壁的PBMC通过CD8磁珠筛选，即得CD8+T细胞，冻存所述CD8+T细胞；S503、第一次预刺激T细胞：收集所述成熟的DC，并分为3份，冻存其中的两份，向剩余一份加入新生抗原多肽共负载；复苏所述CD8+T细胞，并与负载有新生抗原多肽的DC细胞共培养；S504、第二次预刺激T细胞：复苏一份DC细胞，并加入新生抗原多肽共负载；收集第一次预刺激的T细胞，并与负载有新生抗原多肽的DC细胞共培养；S505、处理ELISPOT板；S506、收集第二次预刺激的T细胞；S507、复苏剩余冻存的DC细胞并负载新生抗原多肽；S508、将DC细胞铺于所述ELISPOT板；S509、配制抗体Anti-IFN-γ，并培养所述抗体；S510、去除ELISPOT板内的所述抗体，并清洁所述ELISPO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、从外周血中分离得到外周血单个核细胞；/nS2、在外周血单个核细胞的培养液中加入新生抗原开始共孵育，孵育第十天收集得到预刺激细胞；/nS3、收集预刺激的T细胞，并提取所述T细胞的RNA，反转录成cDNA；/nS4、通过TCR测序得到预刺激后的T细胞的TCR CDR3序列，将测序得到的所述CDR3序列与未经抗原刺激的T细胞的测序结果比对，确定频率上升的TCR。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从外周血中分离得到外周血单个核细胞；
S2、在外周血单个核细胞的培养液中加入新生抗原开始共孵育，孵育第十天收集得到预刺激细胞；
S3、收集预刺激的T细胞，并提取所述T细胞的RNA，反转录成cDNA；
S4、通过TCR测序得到预刺激后的T细胞的TCRCDR3序列，将测序得到的所述CDR3序列与未经抗原刺激的T细胞的测序结果比对，确定频率上升的TCR。


2.根据权利要求1所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述步骤S1中，共孵育第3天和第7天时，还包括更换培养液，并添加IL-2、IL-7、IL-15刺激培养的步骤。


3.根据权利要求1或2所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述步骤S1前还包括：基于非同义突变位点的抗原与相对应主要组织相容性分子的结合能力，预测得到结合能力最强的新生抗原并将所述新生抗原制备为抗原多肽的步骤。


4.根据权利要求3所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述结合能力最强的新生抗原包括序列为：
ISFDTHLLY、VEWLGRCIL、SEIISFKSL、CSTSISNFK、SEHGFGPSL、ATSPASASK、MLICCCCTL、SYFRGSYSY、AAASATLAL、YSLPNAPTV、CWISFDTHLLY、ARPVEWLGRCILDA、LCTDVALPLIVHNIQ、EFTDLLSFIGRIR、HGFGPSLPTSGRDRL、VGLAVNSAVLYVLL、LCKMINLSKPDTI的抗原中的至少一种。


5.根据权利要求4所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述步骤S4所述的测序包括：将所述cDNA作为样本，利用多重PCR技术扩增样本内表达的重组的VDJ基因，然后进行测序。


6.根据权利要求5所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述步骤S4后还包括：
S5、采用IFN-γ免疫斑点法检测TCR数量明显增高的TCR所对应的新生抗原的免疫原性。


7.根据权利要求6所述的同时检测新生抗原免疫原性和新生抗原特异性TCR的方法，其特征在于，所述步骤S5包括：
S501、获取PBMC及培养成熟的DC细胞；
S502、获取CD8+T细胞：将悬浮未...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐云霞，高志博，王煜，张义兴，王佳茜，彭厘旻，
申请(专利权)人：深圳裕泰抗原科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44