食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法及其试剂盒。包括如下步骤：（１）除去待测样品中的大部分蛋白质；（２）除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液；（３）结晶反应和结果判断：往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管中析出针束状晶体；不含三聚氰胺的供试液无析出物。试剂盒包括如下试剂：甲醇、质量百分数１０％的三氯乙酸溶液、三硝基苯酚的饱和水溶液。本发明专利技术的三聚氰胺检测方法成本低、操作简便、省时、不使用贵重仪器、易于为普通工作人员掌握，易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及三聚氰胺的快速检测技术及试剂盒。
技术介绍
三聚氰胺(Melamine)，别名蜜胺，分子式:C3N6H6，分子中氮含 量高达66.7%。三聚氰胺是一种化工原料，可由尿素合成而得，是生 产三聚氰胺-甲醛树脂的原料，应用广泛。但是三聚氰胺不是食品添 加剂。食品和饲料中蛋白质的含量通常采用"凯氏定氮法"测定。该方法 是将蛋白质消化处理，生成铵盐，通过测定氨的含量而算出氮的含量， 再通过氮的含量而推算出样品中的蛋白质含量。现行产品质量标准一 般对含蛋白质较高的食品或饲料原料作出含量最低要求的规定，如生 鲜奶中蛋白质的含量应大于或等于2.95%，即l升生鲜奶中蛋白质的含 量应大于或等于29.5克。由于三聚氰胺在"凯氏定氮法"测定样品时能 增加样品中蛋白质的表观含量(1克三聚氰胺约可增加4克蛋白质的表 观含量)，因此被不法分子违法添加在食品或饲料中。掺假者在生鲜 奶中掺三聚氰胺， 一般在每l升的掺入量在几克以上，否则掺假就没 有意义。2007年，美国报道了宠物猫、狗因食入含三聚氰胺饲料而死亡的 事件，随后美国食品药品管理局(FDA)制订了相应的检验方法。2008 年9月11日，有关部门披露，某些奶粉中含有三聚氰胺，导致了一些婴幼儿因食用含三聚氰胺奶粉而出现肾结石症状，少数婴幼儿抢救无 效而死亡。随后在一些液体奶和与奶粉有关的食品中也检出三聚氰 胺，给整个食品行业带来巨大的冲击，社会影响极坏。其中三鹿奶粉 中有两个批号的产品检出三聚氰胺的含量分别为每千克含二千多毫克和六千多毫克。2008年10月，国家有关部门参考美国食品药品管理 局(FDA)和美国食品化学品法典(FCC)三聚氰胺检测方法，制定 了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》国家标准(GB/T 223888-2008)。该标准中规定乳及乳制品中三聚氰胺可根据限量的要 求，选用高效液相色谱法、液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法中的 其中一种。"三聚氰胺"事件后，国家有关部门的调査结果表明，原料奶在进 入奶制品生产企业进行生产前经历了奶站收购原料奶、运输等环节， 这些环节易被不法分子违法添加三聚氰胺，是风险控制的关键所在， 一旦原料奶混有三聚氰胺而生产企业未及时发现，进入生产环节后将 会导致大量的成品奶受污染。 一吨掺杂的原奶可使几百吨奶制品报 废。如果用受污染原料制成的奶制品进入流通环节，召回产品将会耗 费大量的人力和财力并产生极坏的影响。在奶站和奶制品生产企业收 购原料时对其是否含三聚氰胺进行检验是最为必要和最为经济的。原料奶是低价值商品，奶站收购的原料来自不同的牧场或专业饲 养户，数量多少不一，有的交售一、两百公斤，有的交销两、三吨或 一、二十吨。如果都采用仪器方法进行检验， 一来会大大增加检验成 本导致终端产品的价格明显升高，二来检验周期太长不切合实际(原料奶需低温保存以防变质)，还有就是中小奶制品企业不具备相应的 检验设备和检验人才。其它食品或饲料原料，如豆粉、鱼粉等的收购也面临同样的问题， 在收购原材料的时应检验其是否含有三聚氰胺。现有的检验方法(高效液相色谱法、液-质联用法和气-质联用法) 存在设备投入成本高、检验周期长、检验费用大，检验操作不易为普 通工作人员掌握，在原料收购站、中小企业难以推广等缺点。因此，需要建立检验成本低、操作简便、不使用贵重仪器，省时、 一般工作人员也能掌握的快速检测方法，以对付在食品或词料中掺三 聚氰胺的违法行为，保护企业自身的利益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术上存在的缺点，提供一种低检验 成本、操作简便、省时、不使用贵重仪器、易于为普通工作人员掌握， 易于推广的食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法。本专利技术的另一个目的是提供用于检测食品或词料中三聚氰胺掺 杂的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法，包括如下步骤(1)除去待测样品中的大部分蛋白质对于液态样品，往液态样品中加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三 氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；对于粉末状样品，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；对于颗粒或块状样品，研细或粉碎处理后，先加水、均质，然后 加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离 心处理，取出离心后的上清液；(2) 除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液 上清液流过反相固相萃取柱，残留的微量蛋白质被柱上填料吸附，收集过柱后的流出液作供试液；(3) 结晶反应和结果判断 往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管 中析出针束状晶体(目视可辨别)；三聚氰胺掺杂量越大，析出的速 度越快，晶体的析出量越大；不含三聚氰胺的供试液无析出物。吸出含析出物的液体一滴，置于载玻片上，压片，在低倍显微镜 下检视，析出的晶体呈针束放射状，易于鉴别，即可确证，无需再进 行色谱检验。不含甲醇的三聚氰胺水溶液加入三硝基苯酚饱溶液后立即生成 胶团状析出物。三聚氰胺溶于甲醇或者含甲醇浓度10%以上的水溶 液，所得到的溶液加入三硝基苯酚饱溶液后析出针束状晶体。当不含三聚氰胺的样品，按本专利技术粗除蛋白质之方法处理后得到 的上清液(未过反相固相萃取柱)，取出置于试管中，加入三硝基苯 酚饱溶液后有呈雾状的固体微粒析出，表明上清液(未过反相固相萃取柱)仍然有残留的蛋白质。这些固体微粒在低倍显微镜下检视为无 定形固体(非晶体)。这种上清液流过反相固相萃取柱，用试管收集 过柱后的流出液作供试液，往供试液中加入三硝基苯酚饱溶液后无析 出物，表明过反相固相萃取柱能除去残留的蛋白质。当含有三聚氰胺的样品，按本专利技术粗除蛋白质之方法处理后得到 的上清液(未过反相固相萃取柱)，取出置于试管中，加入三硝基苯 酚饱溶液后有固体微粒析出，这些固体微粒在低倍显微镜下检视为无 定形固体，有的固体体积较小而且不透明，有的固体体积较大而且透 明。如果这种上清液流过反相固相萃取柱，用试管收集过柱后的流出 液作供试液，往供试液中加入三硝基苯酚饱溶液后则有晶状固体析 出，目视呈蓬松团状。这种结晶的单位质量具有较大的目视表观体积从而提高了灵敏度(0.3mg三聚氰胺对应于2—3mL目视结晶体积)， 在低倍显微镜下检视，析出的晶体呈针束放射状，易于鉴别。结果表 明用反相固相萃取柱除去残留的蛋白质有利于晶体的形成。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果1.现有的样品除蛋白质的方法一般采用醇沉淀法、加重金属盐沉 淀法、加热法沉淀法、加三氯乙酸沉淀法等，但溶液中还有较多的蛋 白质残留；seveage法用氯仿一正丁醇混合液加入样品溶液中，在两 相相交界处有蛋白质析出，通过离心除去，如此反复多次，也能较彻 底地除去蛋白质，但操作时间长，手续繁琐。而本专利技术是在普通的粗 除蛋白质之后，通过将离心后的上清液注入反相固相萃取柱，使残留 的微量蛋白质被柱上填料吸附，收集过柱后的流出液作供试液，从而实现除尽溶液中残留微量蛋白质的目的。净化方式为"穿透式"，即填 料不吸附三聚氰胺，不造成提取液中三聚氰胺浓度的下降。2. 本专利技术与己有离子交换柱除蛋白质和大孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
食品或饲料中三聚氰胺掺杂的快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：　（１）除去待测样品中的大部分蛋白质：　对于液态样品，往液态样品中加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；　对于粉末状样品，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；　对于颗粒或块状样品，研细或粉碎处理后，先加水、均质，然后加入甲醇或甲醇水溶液，再加入三氯乙酸溶液，均质、超声处理，离心处理，取出离心后的上清液；　（２）除去上清液中残留的微量蛋白质制得供试液：　上清液流过反相固相萃取柱，残留的微量蛋白质被柱上填料吸附，收集过柱后的流出液作供试液；　（３）结晶反应和结果判断：　往供试液中加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置；当供试液中含有三聚氰胺，加入三硝基苯酚的饱和水溶液，静置后将可观察到试管中析出针束状晶体；三聚氰胺掺杂量越大，析出的速度越快，晶体的析出量越大；不含三聚氰胺的供试液无析出物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱炳辉，高燕红，钟志雄，龙朝阳，杨杏芬，张永慧，
申请(专利权)人：广东省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]