霉菌毒素青霉酸单克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种霉菌毒素青霉酸单克隆抗体及其制备方法。其步骤为将青霉酸分别与载体蛋白偶联获得完全抗原，再以完全抗原免疫小鼠，然后采用杂交瘤技术，经细胞融合、筛选、克隆、扩大培养和动物体内诱生腹水法获得单克隆抗体。所得的抗体效价为１∶２．０５×１０↑［５］，抗体类型为ＩｇＧ１型，与黄曲霉毒素Ｂ１、玉米赤霉烯酮、Ｔ－２毒素和伏马毒素均无交叉反应率，亲和常数为１．５４×１０↑［８］Ｌ／ｍｏｌ，可以用于研制检测青霉酸的ＥＬＩＳＡ试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物免疫
，涉及。
技术介绍
近年来随着养殖业的集约化生产，饲料工业蓬勃发展，由词料霉变问题开始引起人们 的高度关注。霉菌对饲料的污染是十分常见的，伺料被霉菌污染后，除了会引起饲料的变 质外，更为严重的是这些霉菌可以产生具有致畸、致癌、致突变"三致"效应的霉菌毒素 而引起中毒，给养殖业造成巨大的经济损失。据世界粮农组织报告，全球每年大约有25% 的农作物受到霉菌及毒素的污染，造成的直接和间接经济损失达数千亿美元。另外，饲料 中的霉菌毒素还可能通过食物链，或通过吸入及皮肤接触而对人体产生危害。因此，预防 和控制饲料霉菌毒素污染是保障其质量安全的主要内容，而对霉菌毒素的准确、快速检测 则是预防和控制饲料霉菌毒素污染的关键内容。据统计，饲料中真菌有毒代谢产物及真菌毒素共21类，340余种。其中黄曲霉毒素(AF) 为公认的危害最严重的毒素，但由于霉菌或毒素很少是单独存在，且毒素之间有累加、协 同甚至增强作用，这使对其他毒素，尤其是高产毒素的危害引起重视。圆弧青霉菌毒素就 是高产毒素类的一种，由青霉菌属圆弧青霉菌产生，是一类多聚乙酰类霉菌毒素，其中以 青霉酸为主。据袁慧报道，青霉菌在词料中的污染率占89.30%，而圆弧青霉菌占青霉菌污 染率的60. 30%，圆弧青霉菌毒素(青霉酸占90%以上)的平均含量为0. 38%,最高为1. 4%。 Kurtzman &Ciegler曾报道，霉变词料中该毒素含量高达2%。由此可见，词料中圆弧青霉 菌毒素的含量很高。青霉酸(Penicillic Acid， PA)是圆弧青霉有毒代谢产物的主要成 分，自1931年由Alsbrg和Black首次从侵染软毛青霉的玉米中分离出后，到现在查明有 曲霉属、青霉属和瓶梗青霉属共28种真菌能产生青霉酸，是词料中主要真菌毒素之一。 国内外许多研究表明青霉酸对各种动物均具有毒性。何祖平、袁慧等所做的青霉酸对尼西 鸡的毒性作用实验表明，中毒尼西鸡的主要病理变化是肝脏细胞脂肪变性、肾小管上皮细 胞浊肿、心肌细胞颗粒变性；红细胞平均压积(MCV)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC) 显著低于对照组，而谷丙转氨酶(SGPT)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(AKP)等血清酶活性显著高于对照组；青霉酸在各脏器中含量分布依次为肝>肾>心，表明肝脏是青 霉酸作用的靶器官。青霉酸对体外培养的小鼠肺脏巨噬细胞的毒性实验表明，巨噬细胞中 ATP减少，青霉酸能阻止亮氨酸进入蛋白质，从而影响RNA转录和蛋白质合成，阻碍肺泡 巨噬细胞的吞噬功能。青霉酸能抑制Na+、 K+、 Ca2+进入青蛙的离体心肌，引起心脏功能障 碍。有实验表明对体外培养的小鼠成纤维细胞，当青霉酸浓度大于5mg/ml时，可以抑制 DNA的合成，而对体外培养的中国仓鼠卵巢细胞，当浓度大于0.5mg/ml，可以诱导DNA单 链断裂，另有报道PA能抑制细胞凋亡，这些说明青霉酸是一种潜在的致癌物。而且青霉 酸与饲料中其他毒素(如赭曲霉素A、展青霉毒素、红青霉毒素B及桔青霉毒素等)同时存在时，有毒性增强作用。有研究发现，PA能抑制胰羧肽酶A的活性，从而使胰羧肽酶A 对赭曲霉素A的解毒作用得到抑制。当青霉酸与赭曲霉素A共同作用于雏鸡时，引起肝脏 和肾脏的上皮细胞颗粒变性和水泡变性，单核细胞增多，免疫器官(如脾、法氏囊等)萎 縮，淋巴细胞减少。用含有青霉酸与赭曲霉素A的饲料饲喂仔猪，由于协同作用使赫曲霉 素A毒性作用增强，使早期出现肾近曲小管上皮脏细胞变性，后期间质增生；对小鼠的实 验表明，两毒素单独存在时不引起死亡，而同时存在时死亡率达20%，主要病理变化为多 病灶性肾小管坏死。由此可见，青霉酸对动物和人类的健康都构成了严重的威胁。目前，对于青霉酸的测定主要有生物鉴定法、仪器分析法，现在还没有建立免疫检测 方法。仪器分析方法常用的薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)方法操作烦琐、样品 前处理复杂，所需仪器价格昂贵，操作时需要专门的技术人员，不适于推广应用。而免疫 分析法主要应用了抗原抗体免疫反应的特异性，灵敏度高，干扰小，操作简便，非常适合 真菌毒素的快速分析及技术推广。因此，本专利技术提供青霉酸单克隆抗体及其制备方法，为 建立青霉酸免疫快速检测方法奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种青霉酸单克隆抗体。本专利技术的第二个目的旨在提供一种能产生青霉酸单克隆抗体的杂交瘤细胞。 本专利技术的第三个目的旨在提供一种能产生青霉酸单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法。本专利技术的第四个目的旨在提供一种青霉酸单克隆抗体的制备方法 本专利技术的目的是通过以下方式实现的一种青霉酸单克隆抗体是能特异性地与青霉酸结合的IgGl型单克隆抗体，所述单克隆 抗体是完全抗原PA-BSA(预先合成)免疫小鼠脾脏所得脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合得到的杂交瘤细胞产生的。所述的小鼠脾脏是用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价， 选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏；所述的杂交瘤细胞是将免疫3天后脾细胞与 SP2/0细胞按10: 1的比例在50% PH 8.0的PEG作用下进行细胞融合；然后选择性培养，用 己建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞采用有限稀释法进行3 次连续克隆，直到阳性率达100%获得的；所述杂交瘤细胞的染色体数目为95-108条，平均 98条。所得到的单克隆抗体与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素和伏马毒素均无交叉 反应率。制备青霉酸单克隆抗体的方法包括以下步骤将青霉酸分别与载体蛋白偶联获得完全 抗原，免疫小鼠，选择抗血清效价高、竞争抑制强的小鼠脾脏进行免疫，然后采用杂交瘤 技术，把骨髓瘤细胞和免疫的小鼠脾细胞融合、克隆筛选、扩大培养和动物体内诱生腹水 法获得单克隆抗体。制备所述青霉酸单克隆抗体的方法包括以下具体步骤首先合成完全抗原PA-BSA，然 后用完全抗原PA-BSA免疫Balb/c小鼠，免疫四次后采血检测血效价。选择抗血清效价高、 竞争抑制强的小鼠脾脏进行第五次免疫，不加佐剂；免疫3天后取脾细胞与清SP2/0细胞按 10: 1的比例在50% PH 8. 0分子量1450的PEG作用下进行细胞融合；然后用HAT和HT培养基 进行选择性培养，用已建立好的间接ELISA进行阳性克隆的筛选，筛选出的阳性克隆细胞 采用有限稀释法进行3次连续克隆，直到阳性率达100%;再取阳性杂交瘤细胞注射到BALB/c 小鼠腹腔内，每只0.5-lXl(f个细胞，IO天后当小鼠腹部明显增大时收集腹水，离心去油脂 和沉淀后，取上清液，采用饱和硫酸铵和辛酸-硫酸铵沉淀法提纯，获得单克隆抗体。具体检测方法如下1、 通过SDS-PAGE凝胶电泳测定，纯化后的单克隆抗体有一条约57KD的重链带和一 条约25KD的轻链带，蛋白质的分子量为164KD。见图l， 1:两次纯化后的单抗 2:粗提 纯后的单抗M:低分子量蛋白标准。2、 根据紫外扫描结果计算出单克隆抗体蛋白质的含量为2.56mg/mL。间接ELISA法检测 单克隆抗体亚类的免疫球蛋白亚型为IgGl型，杂交瘤细胞株上清液体的抗体效价为l: 400， 腹水的效价为l: 2.05X 105。3、 用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉酸单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是能特异性地与青霉酸结合的ＩｇＧ１型单克隆抗体，所述单克隆抗体是完全抗原ＰＡ－ＢＳＡ免疫小鼠脾脏所得脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合得到的杂交瘤细胞产生的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧，雷红宇，邬静，文利新，李荣芳，袁莉芸，
申请(专利权)人：湖南农业大学，袁慧，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]