甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法，具体包括以下步骤：将种子压扁用２－氯乙醇溶液浸泡２～３ｈ提取醇溶蛋白，然后用分离胶和浓缩胶进行电泳分离，电泳结束后进行固定、染色、脱色显带，最后通过读带计算出油菜杂交种种子的纯度。本发明专利技术的鉴定方法具有操作简单、成本低、效率高、准确性高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于油菜育种与应用
，具体涉及油菜杂交品种种子纯度的鉴定方法。
技术介绍
杂交油菜作为我国推动油菜生产发展的主要育种技术近年取得了快速发展，显著特征是 育成品种越来越多，应用范围越来越广。随着杂交油菜的日益普及，种子的纯度质量控制则 显得越来越重要，尤其是对以细胞质雄性不育为主体的杂交种类型，该不育类型的母本对温 度反应敏感，在低温下易产生微量花粉，并以自交方式产生不育母本型假杂种，严重时可造 成杂交油菜的大幅度减产。因此，在油菜杂交种应用于生产以前，必须进行严格的纯度鉴定。种子纯度鉴定仍是目前困扰油菜种子检验工作的一个难题。目前我国油菜杂交种纯度鉴 定大多采用异地异季种植鉴定，然而异地异季鉴定的缺陷也日益突出 一则鉴定周期长，满 足不了生产销售的时间要求；二则冬性强的品种可能会因春化受阻不能进行鉴定；再则，异 季鉴定要求及时播种，需要在种子未完全成熟时进行取样，样品种子的发芽率低，极有可能 造成鉴定结果与真实值不符。因此，快速、可靠的杂交油菜纯度鉴定方法在油菜生产应用中 显得极为紧迫和必要。生化标记具有简便、廉价、高效等优点，特别是以同工酶、贮藏蛋白电泳技术为代表的 生化标记，目前已经被广泛应用于农作物的种子纯度鉴定工作，并取得了较好的效果。随着 生化技术的不断发展，国内外学者不断致力于各种生化标记电泳检测技术的标准化研究，技 术得到了不断地完善。近几年，同工酶已开始被应用于油菜的品种纯度鉴定，例如利用酯酶 同工酶谱分析鉴定杂交油菜秦优2号种子的纯度结果与种植鉴定吻合，还有利用酯酶同工酶 和AFLP (扩增片段长度多态性)标记鉴定甘蓝型油菜"中油杂2号"种子纯度的结果和种植鉴 定、AFLP均很吻合。然而，同工酶鉴定方法需要对油菜育苗，从发芽到出苗需要几天的时 间，并且同工酶电泳谱带较模糊，易错读而造成鉴定结果出现偏差，给纯度鉴定带来诸多不 便。醇溶蛋白电泳技术直接以种子为材料进行分析，不需要育苗，作为一种贮藏蛋白电泳技 术已在小麦、玉米、水稻等禾本科作物的种子纯度鉴定中得到应用，但是甘蓝型油菜种子醇 溶蛋白含量很少，利用目前禾本科作物上广泛应用的电泳、染色方法较难进行检测，而其他 生化鉴定及分子标记方法操作步骤复杂、成本较高、检测周期较长。迄今为止，尚未有成功 利用醇溶蛋白电泳技术鉴定杂交油菜种子纯度的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、效率高且能有效鉴定杂交种子纯度的。为解决上述技术问题，本专利技术的要点在于利用已有的禾谷类作物上的醇溶蛋白提取技术 和油菜的同工酶电泳技术，组合并研制了一套适合于甘蓝型油菜醇溶蛋白的电泳检测技术， 并应用到甘蓝型油菜杂交品种纯度的鉴定工作中。为此，本专利技术提出的技术方案为一种甘蓝 型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法，具体包括以下步骤(1) 醇溶蛋白提取将甘蓝型油菜杂交种样品种子(数量可以为150-250粒)及其父母本的种子(例如5~10粒)压扁，每粒种子用35~4(^1的2-氯乙醇溶液浸泡2~3h，所述2-氯 乙醇溶液中溶质的体积分数为20~30%;(2) 电泳分离选用双夹芯式垂直平板电泳槽(可外购，按商品说明书组装)，往所述电泳槽的胶室中灌分离胶室离胶室的后玻璃板顶端3 4cm处，待分离胶凝固后，再往胶室中 灌浓縮胶至胶室的后玻璃板顶端，插好点样梳，光照下静置待浓縮胶凝固；拔出点样梳，取 每粒种子的浸泡液30~35^1上样于点样孔中，上样完毕后将电泳槽注满pH值为8.0~8.5的电 极缓冲液，并往电极缓冲液里滴加溴酚蓝溶液作指示剂；在20 40mA条件下稳流电泳，电泳 过程中低浓度的醇溶蛋白经过浓縮胶后被浓縮成薄层，以便于提高分辨率；待指示剂溴酚蓝 由浓縮胶顶端向下移动至分离胶顶部时，调电流至50 70mA继续稳流电泳，在分离胶中各种 醇溶蛋白将根据不同的电荷效应和分子筛效应分别聚集于分离胶的不同位置，待溴酚蓝下移 至分离胶底部时结束电泳；(3) 染色显带电泳结束后，从电泳槽中取出分离胶，并将其置于固定液中固定 20 30min，然后用染色液染色30 40min，最后在脱色液中脱色至肉眼可见的谱带出现；(4) 读带将上述脱色后的分离胶置于观片灯上读带，对比油菜杂交种及父、母本种子 的谱带特征，统计出油菜杂交种种子样品中具有母本谱带特征的种子数量，根据计算公式计 算出油菜杂交种种子的纯度，所述计算公式为油菜杂交种种子纯度=(l-具有母本谱带特征的种子数量/杂交种种子样品检测数量) xlOO%。上述鉴定方法主要是利用了甘蓝型油菜亲本间醇溶蛋白具有差异性的特点，在实施本发 明方法的读带过程中，具有父、母本双方谱带特征的个体为真杂种，只具有母本谱带特征的 个体为假杂种，据此便可计算出送检杂交种种子样品的纯度。上述鉴定方法所用到的分离胶中，丙烯酰胺的质量浓度为7~10%;浓縮胶中丙烯酰胺的 质量浓度为2.3-2.5%;所述溴酚蓝溶液中溶质的质量浓度为0.1~0.2%。上述鉴定方法的电泳分离步骤中，分离胶凝固所需的时间优选30 40min;浓縮胶凝固所 需的时间优选20 30min上述鉴定方法中用到的固定液由三氯乙酸、甲醇和双蒸水配制而成，其中三氯乙酸的质 量浓度为10~15%，甲醇的体积分数为20~40%;所述染色液由乙醇、冰乙酸、考马斯亮蓝 R-250、考马斯亮蓝G-250和双蒸水配制而成，其中乙醇的体积分数为20~30%，冰乙酸的体 积分数为5~15%，考马斯亮蓝R-250的质量浓度为0.01 0.02%，考马斯亮蓝G-250的质量浓 度为0.04~0.05%;所述脱色液由乙醇、冰乙酸和双蒸水配制而成，其中乙醇的体积分数 10 15%，冰乙酸的体积分数为5~10%。与现有技术相比，本专利技术的优点在于本专利技术中的醇溶蛋白提取步骤不需研磨和离心， 可大大减少工作量，提高工作效率；本专利技术筛选并改良的电泳分离工艺及染色显带技术，具 有操作简便、分辨率高、带纹清晰等技术优势。利用本专利技术方法与田间种植鉴定、简单重复 序列(SSR)鉴定对同一批样品进行纯度分析，分析结果显示本专利技术具有与其它现有鉴定技 术同等的准确性和可靠性，更重要的是本专利技术的鉴定方法操作更为简单、成本更低、效率更 高，有效地克服了油菜种植鉴定方法周期长的缺陷，又比SSR鉴定方法简单可行、易于推广， 这为降低甘蓝型油菜杂交品种推广应用中的风险提供了技术保障。 附图说明图1为油菜杂交品种"丰油701"的母本、父本和真杂种的醇溶蛋白电泳图谱，其中泳道A、 B、 C分别代表母本、父本和真杂种。图2为本实施例中"丰油701"杂交种部分样品种子的检测结果，其中泳道Pl代表母本， 具有图示的a、 b两条谱带；泳道P2代表父本，具有a、 b、 c三条谱带；泳道F为检测到的 假杂种，只有a、 b两条谱带。 具体实施例方式实施例利用本专利技术方法对湖南省作物研究所选育的甘蓝型油菜杂交品种"丰油7or进行检测，以下为检测方法的具体操作流程1、主要试剂的配制(1) 醇溶蛋白提取液取25ml2-氯乙醇，用双蒸水(ddH20)定容到100ml， 4'C保存；(2) 贮备液I :取30g丙烯酰胺和0.8g亚甲基双丙烯酰胺，用ddH20定容至100ml， 4°C保存；(3) 贮备液I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蓝型油菜杂交种种子纯度快速鉴定方法，具体包括以下步骤：　（１）醇溶蛋白提取：将甘蓝型油菜杂交种种子及其父母本的种子压扁，每粒种子用３５～４０μｌ的２－氯乙醇溶液浸泡２～３ｈ，所述２－氯乙醇溶液中溶质的体积分数为２０～３０％；（２）电泳分离：选用双夹芯式垂直平板电泳槽，往所述电泳槽的胶室中灌分离胶至离胶室的后玻璃板顶端３～４ｃｍ处，待分离胶凝固后，再往胶室中灌浓缩胶至胶室的后玻璃板顶端，插好点样梳，光照下静置待浓缩胶凝固；拔出点样梳，取每粒种子的浸泡液３０～３５μｌ上样于点样孔中，上样完毕后将电泳槽注满ｐＨ值为８．０～８．５的电极缓冲液，并往电极缓冲液里滴加溴酚蓝溶液；控制电流为２０～４０ｍＡ条件下稳流电泳，待指示剂溴酚蓝由浓缩胶顶端向下移动至分离胶顶部时，调电流至５０～７０ｍＡ继续稳流电泳，待溴酚蓝下移至分离胶底部时结束电泳；　（３）染色显带：电泳结束后，从电泳槽中取出分离胶，并将其置于固定液中固定２０～３０ｍｉｎ，然后用染色液染色３０～４０ｍｉｎ，最后在脱色液中脱色至肉眼可见的谱带出现；　（４）读带：将上述脱色后的分离胶置于观片灯上读带，对比油菜杂交种及父、母本种子的谱带特征，统计出油菜杂交种种子样品中具有母本谱带特征的种子数量，根据计算公式计算出油菜杂交种种子的纯度，所述计算公式为：　油菜杂交种种子纯度＝（１－具有母本谱带特征的种子数量／杂交种种子样品检测数量）×１００％。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫江，王同华，曲亮，李莓，范连益，
申请(专利权)人：湖南省作物研究所，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]