1,5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒及检测方法技术

１，５－脱水葡萄糖醇检测试剂盒，包括：（１）对照品：含０．０２－１００μｇ／ｍｌ１，５－ＡＧ和０．４－４０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－［１３］↑Ｃ↓［６］］１，５－ＡＧ）的８０％甲醇溶液；（２）质控品：含０．０６－８０μｇ／ｍｌ　１，５－ＡＧ和０．４－４０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－［１３］↑Ｃ↓［６］］　１，５－ＡＧ）的８０％甲醇溶液；（３）蛋白沉淀剂：０．５－５０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－［１３］↑Ｃ↓［６］］　１，５－ＡＧ）的甲醇或乙腈。采用液相色谱串联质谱测定法检测。本发明专利技术的优点是：配制的对照品和质控品溶剂，无需处理可直接进样，采用蛋白沉淀剂合并内标的方案，既简化了操作步骤，又保证了测定结果的正确性。本发明专利技术还对液相条件和质谱条件进行了优化，可获得较好的峰形、灵敏度和特异性。方法简便、准确、快速、稳定，无需衍生化、酶转化等复杂步骤，检测结果不受内源性物质的干扰，且试剂成本低廉，适用于临床大量样本的检测要求。

【技术实现步骤摘要】
,5-脱水葡萄糖醇检测试剂盒及检测方法
本专利技术属临床生化检测领域，具体涉及一种用液相色谱串联质谱技术测定， 5-脱水葡萄糖醇的检测试剂盒。
技术介绍
美国糖尿病控制与并发症研究小组(DCCT)指出预防糖尿病并发症的重要性 在于严格的血糖控制。当前血糖控制的有效指标主要包括糖化血红蛋白、糖化血 清蛋白、空腹血糖及餐后血糖，这些指标在反映血糖水平上各有特点。糖化血红 蛋白是测定长期血糖水平(2 3月)的金标准，作为糖尿病并发症风险预测因 子，在临床上广泛应用。但是该指标受红细胞寿命影响，不能反映近期血糖控制 情况。糖化血清蛋白反映l-2周前的平均血糖水平，它受白蛋白量的影响，每天 的波动较大。空腹和餐后2h血糖反映瞬间血糖水平，是糖尿病诊断筛选的常用 指标，但对一段时间的血糖控制情况则无法提供信息。临床研究证实，， 5-脱水葡萄糖醇(， 5-anhydroglucito ，简称, 5_AG) 能快速、灵敏地反映数天内血糖波动情况和餐后高血糖的变化情况，可作为短期 血糖控制的指标。， 5-AG是吡喃葡萄糖的Cl-脱氧形式，又称l， 5-脱水山梨醇，是存在于人 脑脊液、血清和血浆中的多元醇糖类物质的一种，含量仅次于葡萄糖，在肾小管 重吸收时被葡萄糖竞争性抑制，故在糖尿病人血中l， 5-AG含量明显下降。有研 究表明，在糖尿病时血中， 5-AG浓度下降，是一种可靠的、不受检测条件的影响、 单项结果可以作为诊断糖尿病血糖控制的有效指标。日本已将l， 5-AG检测列为 糖尿病管理的常规指标，而美国近年来的临床试验也证实了 , 5-AG在短期血糖 控制方面的可行性。本研究显示l, 5-AG与现有的血糖指标均呈现显著的负相关，血浆，5-AG的 减少程度与糖尿病严重程度显著相关。， 5-AG与其他指标最显著的区别是反应 血糖变化的周期不同，而目前在糖尿病血糖监测指标中缺少短期的血糖监测指 标，l， 5-AG则弥补了血糖监测指标的不足，它可反映近几天至l周的血糖水平。有文献报道在短时期内， 5-AG的敏感性明显高于HbAlC。 ， 5-AG水平变化范 围较大，特别在血糖接近正常血糖水平时。当HbAlC控制良好时，而， 5-AG 不一定控制良好。如果出现， 5-AG单独偏低说明糖尿病控制程度出现急骤恶化， 或者血浆葡萄糖水平的波动加大，这种现象尤见于I型糖尿病人。， 5-AG作为 糖尿病血糖控制的新指标，能灵敏、准确地反映短期血糖控制水平，其测定不受 采样条件影响(全血、血清或血浆标本均可，这三者呈显著相关，相关系数r > 0.98)，标本可长期保存集中测定，并且不受年龄、饮食、肥胖、运动、应激及服 用各种药物等影响，具有良好的临床应用价值。有研究表明， 5-AG能有效的监 测餐后高血糖，可作为诊断糖尿病情好转与恶化趋势的敏锐指标，是对糖尿病全 面监测的有效补充。因此选择l， 5-AG作为血糖监测指标，结合HbAlC、 PPG等 其他监测指标，评估血糖控制情况，将有利于对糖尿病患者更全面地血糖监测， 使血糖控制在理想的范围。目前国内外主要采用全酶法测定l, 5-AG，，基于该原理的GlycoMark检测试 剂盒2003年获得了美国FDA的批准。全酶法检测过程中，需要一系列的酶参与 以消除葡萄糖干扰和生成有色物质进行检测，主要的吡喃糖氧化酶(PROD)来源 困难,且试剂价格昂贵，检测容易受到内源性物质如葡萄糖、结合型胆红素、血 红蛋白等干扰，其特异性有待进一步提高。在尿毒症病人中，血清肌酐的浓度明 显升高，利用全酶法测定，导致过高的评价血清l， 5-AG的浓度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能快速、灵敏地反映数天内血糖波动情况和餐后高 血糖的变化情况指标， 5-AG的检测试剂盒及检测方法。 本专利技术公开的l， 5-AG检测试剂盒组成包括. 对照品:含0. 02 00 Pg/ml ， 5-AG和0. 4 4(Hig/ml内标( ， 5-AG)的80%甲醇溶液。(相当于血样浓度O. 500 Pg/ml ， 5-AG)。2. 质控品:含O. 06 80 Pg/ml ， 5_ AG和0. 4 40Hg/ml内标( ， 5-AG)的80%甲醇溶液。(相当于血样浓度O. 3 400 Pg/ml ， 5-AG)。3. 蛋白沉淀剂:0.5-50Pg/ml内标( ， 5-AG)的甲醇或乙腈。 采用本专利技术试剂盒进行l， 5- AG检测的步骤包括l.血样采集采集静脉血至样品管中，室温放置，8小时内离心分离血浆。2. 血样预处理取待测血浆于. 5ml离心管中，加2 0体积蛋白沉淀剂旋 涡振荡IO sec，离心(5000 gX3 min)沉淀蛋白，取上清液进样测定。3. 标准曲线的制备取对照品和质控品直接进样。4. 液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定条件 4. 色谱条件高效液相色谱仪(HPLC)，包括泵、进样器、柱温箱和在线脱气仪等模块。 分析柱采用硅胶键合相填料柱，包括氨基柱、硅胶柱、糖柱、氰基柱等类型分析 柱，柱内径为.0 5.0mm，柱长为30 250 mra。流动相由A相+8相组成A 相为乙腈或甲醇，B相为水，A:B体积比为(20-90%) : (0-80%)，采用等度 洗脱，流速0.3mL/min，采用等度洗脱；或者梯度洗脱(随洗脱时间梯度变化， 根据不同类型的分析柱进行设计和调整)，对于氨基柱，当A为乙腈，B水为时， 可参考表l配比进行表梯度洗脱时流动相啊A和B体积比时间(min) A (%) B (%)0 95 53 30 704 30 70 4. 95 54. 2质谱条件电喷雾电离源(ESI)，负离子多反应监测扫描(MRM)。电喷雾电压-4500V， 离子源温度450。C。离子选择通道(Ql/Q3): ， 5-AG/z /zl63>0， IStz /z69 〉05。离子通道范围可为土l.O amu。5.浓度计算方法和检测限按内标法以峰面积或峰高法，计算l， 5-AG在血中的含量。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益结果本专利技术， 5-AG检测试剂盒，配备了用于测定含量的对照品和检验方法稳定 性的质控品，配制的对照品和质控品溶剂，无需处理可直接进样，采用蛋白沉淀 剂合并内标的方案，既简化了操作步骤，又保证了测定结果的正确性。本专利技术还 对液相条件和质谱条件进行了优化，以氨基柱为分析柱，乙腈-水为流动相，等度洗脱，在负离子模式下，以多反应监测(MRM)进行定量，可获得较好的峰形、 灵敏度和特异性。在 50 Pg/ml范围内， 5-AG线性关系良好(r〉0.999)， 批内、批间精密度(RSD%)分别《6. 37%和《8. 75%，准确度为96. 2 03. %。 本方法简便、准确、快速、稳定、特异性强、灵敏度高，对待测物进行直接 检测，无需衍生化、酶转化等复杂步骤，检测结果不受内源性物质的干扰，且试 剂成本低廉，适用于临床大量样本的检测要求。 具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步阐述，但并不限制本专利技术。 实施例试剂盒在临床样品测定上的应用用本试剂盒测定了 59例2型糖尿病患者和290例对照人群血浆的， 5-AG 含量，对照组包括267例体检人群和23例老年非糖尿病患者，其年龄、性别和 ， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１，５－脱水葡萄糖醇检测试剂盒，其特征在于组成包括：　（１）对照品：含０．　０２－１００μｇ／ｍｌ１，５脱水葡萄糖醇和０．４－４０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－↑［１３］Ｃ↓［６］］１，５脱水葡萄糖醇）的８０％甲醇溶液；　（２）质控品 ：含０．　０６－８０μｇ／ｍｌ１，５－ＡＧ和０．４－４０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－↑［１３］Ｃ↓［６］］１，５脱水葡萄糖醇）的８０％甲醇溶液；　（３）蛋白沉淀剂：０．５－５０μｇ／ｍｌ内标（［ＵＬ－↑［１３］Ｃ↓［６］］１，５脱水葡萄糖 醇）的甲醇或乙腈。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余琛，盛宏光，李水军，刘罡一，贾晶莹，缪怡，衡晓香，陆川，张梦琪，周菊珍，
申请(专利权)人：上海市徐汇区中心医院，余琛，盛宏光，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]