皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法，用于血清中皮质醇的定量分析。本发明专利技术的试剂盒即有效的采用生物素－亲和素系统保证了免疫反应体系的稳定性，也利用化学发光技术确保了检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床血液免疫检测
，具体地，本专利技术提供了一种皮质醇 化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒灵敏度高，特异性强，操 作简便，稳定可靠。
技术介绍
皮质醇(Cortisol, Cor)是肾上腺皮质束状带分泌的糖皮质激素，对体内糖、 蛋白质、脂肪的代谢以及维持机体水、电解质平衡等一系列生命活动起重要调节 作用。同时皮质醇也是主要的应激性激素，在创伤、感染、运动、情绪激动等情 况下均有明显的升高，各种原因的肾上腺分泌皮质醇机能亢进或低下，均可明显 干扰机体的正常生理功能，产生特征性临床表现，因此测定皮质醇有广泛的临床 和科研价值。化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫 分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的 高选择性的新的免疫分析技术。生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS) 具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性 好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相上会存在单克隆抗体用量大，活 性损失大等缺点，而且工艺优化较为繁琐，而将链亲和素包被于固相载体上，将 捕获抗体生物素化，以上问题即可迎刃而解。本专利技术将捕获单克隆抗体生物素化， 用碱性磷酸酶(ALP)标记待测皮质醇抗原，生物素化单克隆抗体和酶标记抗原 用稀释液以一定比例稀释成工作溶液。检测操作时将血清样品、生物素化单克隆 抗体溶液和酶标记抗原溶液依次加入包被有链亲和素的固相，经过免疫反应后， 在固相上形成的链亲和素-生物素化抗体-待测抗原或链亲和素-生物素化抗体-酶 标记抗原的免疫复合物，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光 强度，就可以定量分析血清中皮质醇的含量。本专利技术通过检测高灵敏特点的化学发光光信号，而不是传统酶联免疫分析的 显色反应的颜色信号，其灵敏度得到大大提高，可以达到10—18mOl/mL。而继承了传统酶联免疫分析方法的简便操作，可实现大批量快检测，适用性更广，更易在临床诊断和科研工作应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂 盒的制备方法。根据本专利技术的皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒包括皮质醇校准品；链 亲和素包被的固相；生物素化皮质醇单克隆抗体；碱性磷酸标记的皮质醇抗原； 化学发光底物；以及洗涤液。皮质醇系列校准品以小牛血清为基质，加入皮质醇纯品配制而成。链亲和素溶于碳酸缓冲液，然后包被在固相栽体上，固相载体可以为包被 有微孔板、塑料珠、塑料管。生物素化皮质醇单克隆抗体，通过纯化的皮质醇单克隆抗体和生物素偶联形 成，工作浓度0.02 pg/mL。标记抗原所用标记酶为碱性磷酸酶，碱性磷酸酶标记采用改良的戊二醛交联 法，所得酶标记抗原工作浓度为1: 1000-4000。根据本专利技术的皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒制备方法，包括以下步 骤配制皮质醇校准品；以链亲和素包被固相载体，皮质醇单克隆抗体生物素化； 以碱性磷酸酶标记抗皮质醇抗原；浓縮洗漆液；化学发光底物；上述半成品组分 的分装以及组装为成品。l校准品的配制皮质醇纯品，加入校准品基质溶液，配制一中间浓度校准品浓溶液，然后采 用逐点稀释的方法，配制成0、 10、 40、 100、 200、 500 ng/mL的系列校准品， 校准品用国家标准校正。所述基质溶液为100%小牛血清灭活、离心、过滤，加 0.1% Proclin-300。经浓度校准后的皮质醇校准品，用3mL透明玻璃瓶，0.5m1/ 瓶分装，贴上标签，冷冻或者2 8'C保存。2固相载体的制备1)包被采用0.05mol/L， pH值为7.2的PBS与适当浓度的皮质醇单克隆抗体混合制 成包被液，并将其负载于固相载体上，固相载体为微孔板、塑料珠、或塑料管。2) 封闭配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH2P04 2H20、 2.9g NaH2P04 12H20、 100ml小牛血清和lmLProclin-300，所述封闭液的pH值为 7.0 7.4，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。3) 分装、保存去除固相抗体表面的封闭溶液，放置在干燥间自然干燥，用铝箔袋，放入干 燥剂，密封，贴上标签，2~8°C保存。 3酶标记抗体的制备酶标记的皮质醇抗原采用改良的戊二醛交联法标记碱性磷酸酶(ALP)，将 浓的酶标记抗体，用酶稀释液稀释到工作浓度，所述酶用酶稀释液稀释成工作酶 溶液，酶标记抗体稀释比例为1: 1000-1: 4000。用15mL白色塑料瓶按需要分 装，贴上标签，2~8°C保存。4生物素化抗体的制备皮质纯单克隆抗体和生物素通过偶联反应形成生物素化抗体，将浓的生物素 化抗体，用酶稀释液稀释到工作浓度，所述抗体工作溶液浓度约0.02 pg/mL。用 15mL白色塑料瓶按需要分装，贴上标签，2~8°C保存5洗涤液和发光底物分装洗涤液和化学发光底物，按照需要分装，贴上标签，2~8'C保存。 根据本专利技术的方法，所述成品组装的成品包括皮质醇校准品一套，固相抗 体一包，生物素化抗体溶液一瓶，酶标记抗原工作溶液一瓶，洗涤液一瓶，化学 发光底物一瓶，试剂盒使用说明书一张以及其它附件组装而成。本专利技术建立了人血清皮质醇的检测方法，可以定量检测出病人血清内的皮质 醇含量，并且根据皮质醇含量的多少辅助判断疾病的治疗效果及其病情变化。该 皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒的各项指标均达到同类进口试剂盒的分析 法水平，灵敏度高、特异性好，操作简便，稳定可靠。附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图(附图浓度单位ng/mL)。 具体实施例方式实施例1制备本专利技术的皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒一、皮质醇校准品的制备 以小牛血清为基质，将提纯的人精液桨浓原料以国家标准品为准系列稀释而 成。小牛血清使用前需要56。C灭活30分钟，加入O. l%Proclin-300。分装浓度 范围为0、 10、 40、 100、 200、 500 ng/mL的校准品共6瓶。二、 酶标皮质醇抗原的制备(1)改良的戊二醛交联法标记碱性磷酸酶(ALP)1) 取ALP 1. Omg和皮质醇抗原2. Omg，分别溶于生理盐水中，混合，最终 体积控制在0. 50ml;2) 加入0.50ml 1%的戊二醛，室温磁力搅拌15min后，避光反应4h;3) 加入1.Omol/L的乙醇胺O. 10ml，室温温育2h;4) 4t:条件下用PBS加磁力搅拌过夜透析，更换透析液两次；5) 将透析产物移入试剂瓶加入等体积甘油，混匀，加入WBSA，密闭冷冻 保存备用。(2) 酶标抗原稀释液lOOOmL酶稀释液里含有磷酸二氢钠0.2 g，磷酸氢二钠2.9 g，氯化钠8.8 g, BSA 5g， Proclin-300 lml。 pH调整到7. 0-7. 2。(3) 酶标记抗体工作溶液浓度选定试验证明，采用方阵法选择酶标抗原的工作浓度范围为1:1000 4000。(4) 酶标记抗体工作溶液制备用所述(2)稀释液，按照(3)所述稀释比例，将浓酶标记抗原稀释成工作 溶液。三、 以链亲和素包被固相载体 (1)包被釆用0. 05 mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮质醇化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：皮质醇校准品；链亲和素包被固相载体；生物素化皮质醇单克隆抗体；碱性磷酸标记的皮质醇抗原；化学发光底物；以及洗涤液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：石根，应希堂，胡国茂，郑金来，唐宝军，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]