乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种乙型肝炎病毒前Ｓ１与前Ｓ２联合检测试剂盒。包括包被反应条（４８或９６孔）、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色Ａ液、底物显色Ｂ液和终止液。本发明专利技术的试剂盒能同时检测前Ｓ１抗原和前Ｓ２抗原，使用方便，结果准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制剂
具体涉及乙型肝炎病毒前Sl (preSl)抗原 和前S2 (preS2)抗原酶联免疫联合检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
肝脏是维持生命的重要器官之一，肝脏受损的最重要因素之一是病毒感染。 至今，已经鉴定出甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒等五种不同类型的受 损肝脏的肝炎病毒。其中，由于乙肝病毒(HBV)破坏肝细胞而发展成慢性肝 炎以及持续的病毒复制会导致肝硬化的可能性一直被人们广泛研究。乙型肝炎病毒(HBV)是一环状的部分双螺旋结构,长约3.2kb。 HBV基因 组编码HBV抗原，所有四个功能性读码框架位于DNA负链，P基因编码DNA 聚合酶。C基因编码HbcAg。 S基因编码S抗原，前S1抗原和前S2抗原。X基 因编码X产物。在S基因前面的两个小ORFs (开放阅读框open reading frame) 与S基因ORF属于同一个读框，可以将ORFS通读下去，编码两种S蛋白相关 的抗原，这两种抗原也存在于病毒颗粒的表面，这两个抗原分别称为前-Sl(pre-Sl) 和前一S2(pre-S2)。同样，在ORFC前面也有一短的ORF，称为前一C(pre-C)， 编码一较大的C蛋白相关抗原。所有这些ORF都在负链DNA (长链)上，其中 S基因完全重叠于聚合酶基因中，X基因与聚合酶基因、C基因重叠，C基因与 聚合酶也有重叠。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是一组构成病毒外膜的蛋白，其重要功能之 一是识别肝细胞膜上的受体，使病毒与细胞接触，然后侵入胞内进行复制。HBsAg含有大、中，小3种分子形式蛋白质、它们都由病毒基因的S-开放阅读框 架(S-0RF)所编码。其中小分子蛋白(SHBs)即主蛋白由226个氨基酸组成，中蛋 白(MHBs)是在主蛋白N端加上55个氨基酸的preS2区，大分子蛋白(LHBs)根据 病毒的亚型不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119个氨基酸组成的preSl 区，这3种蛋白分子都存在糖基化和非糖基化的形式。从血清中分离得到不同形 态的病毒颗粒表面，SHBs含量最高，但MHBs和LHBs含量各异，在22 nm球形空 壳颗粒中，LHBs含量极低，而含DNA的完整的病毒颗粒中LHBs的含量可达20%。HBV—DNA检测通常被作为HBV感染及复制的金标准，可用PCR方法测定 HBV-DNA，但PCR方法操作要求高、成本高、需要较高的实验条件，在许多基层医 疗单位尚不能开展而使其应用受限。传统认为在检测血清中乙肝"两对半"指标 中，HBeAg转阴表示HBV复制的停止，但在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中，若 前c区发生终止密码子突变时，或当位于x读码区的c启动子发生突变时，HBeAg 表达就会终止或减少，导致HBeAg合成障碍，HBeAg呈阴性，但HBVDNA仍为阳性， 病毒复制并未受到影响，说明HBeAg阴性并不能作为HBV复制终止理想的判断依 据，因此探索新的判定HBV复制的免疫血清学指标已成为目前的研究热点之一。前S1抗原(Pre-SlAg)的临床意义和用途1、反映HBV的感染与复制状况的 指标，很多文献报道(刘拓等，乙型肝炎病毒前S1蛋白检测及临床意义，宁夏医学 杂志，2006, 28:204-205)(乐爱平等，HBVpreS1-Ag、 HBV-DNA、 HBVM的相关性分析 及其意义，江西医学院学报，2004， 44: 27-30)前Sl抗原可作为HbeAg和HBV-DNA 检测的补充和对照，可弥补因病毒变异和其它原因造成的HBeAg (-)的"误寻"。 2、应用于预后及药物疗效的判断，急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后 越好，是病毒清除的最早迹象，反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎， 因病毒基因变异的HBeAb(+)慢性乙型肝炎病人，较易进展为肝硬化，甚至肝癌。 加强检测前S1抗原，是一种检测疾病预后的良好手段。3、早期诊断乙型肝炎病毒的感染，前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期，在转氨酶升高前即可査出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染。在体检和献血员中加査前si抗原，可起来疾病的早期诊断和尽早切断传染原的重要作用。前S2抗原(Pre-S2)上有多聚人血清白蛋白的结合位点，参与HBV感染肝细 胞的过程，在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起着重要的作用。文献报道也可将 Pre-S2作为HbsAg无症状携带者有无传染性的一项特异而敏感的观察指标。(俞 树高等，HbsAg无症状携带者血清HBV DNA与PreS2关系初探，福建医学院学报， 1992， 26: 290-292)。乙型肝炎前S1、前S2抗原不仅仅是HBV感染的新标志，还可作为病毒复制和 急慢性乙肝的预后判断的指标，HBVPreSl-Ag、 PreS2-Ag的连续监测也是免疫清 除HBV、抗病毒治疗及疾病预后的良好观察指标。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种能同时检测 前S1抗原和前S2抗原的试剂盒。本专利技术提供了一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒。试剂盒中各组成成分包括抗体包被反应条48或96孔、酶标记抗体工作液 1瓶(3.5ml或7ml)、阳性对照液1支(0.5ml或lml)、阴性对照液1支(0.5ml 或lml)、 20倍浓縮洗涤液1瓶(10ml或24ml)、底物显色A液1瓶(3.5ml或 7ml)、底物显色B液1瓶(3.5ml或7ml)和终止液1瓶(3.5ml或7ml)。阳性对照制备HbeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者的血清。阴性对照的制备正常人血清。底物显色A液Na2HP0412H20 (1.7 g/100 ml)、柠檬酸(0.5 g/100 ml)、 3%H202 (200ul細ml)。底物显色B液Na2HP0412H20 (1.7 g/100ml)、柠檬酸(0.5 g/100ml)、 四甲基联苯胺(0.15 g/100 ml)。 终止液2mol/LH2S0420倍浓縮洗涤液Na2HP0412H20 (2.6 g/100 ml)、 NaH2P042H20 (0.4 g/100 ml)、 20%Tween-20 (2.5 ml/100 ml)。酶标记抗体工作液Na2HP0412H20 (1.86g/L)、 KH2P04 2H20 (0.22g/L)、 NaCl (9g/L)、牛血清白蛋白(10g/L)及按合适浓度稀释好的酶标记抗体。抗体包被反应条包被抗体以I-IO ug/ml加入到配制好的碳酸盐缓冲液 (Na2C03: 1.6g/L、 Na2HC03: 2.93 g/L)中，然后以IOOul/孔加入到微孔板中， 置4'C湿盒中静置过夜甩干。本专利技术的另一目的是提供了上述乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒 的制备方法。(1) :釆用基因重组的HbsAg制备HbsAb包被抗体或酶标记抗体；(2) :采用基因重组的preSl Ag、前S2多肽制备抗前S1、前S2包被抗体 或酶标记抗体；(3) :抗血清或腹水用硫酸铵沉淀、亲和层析柱(ProteinA/G)或离子交换 层析法(DEAE-Sepharose)纯化得到纯抗体；(4) :制备预包被板抗体做包被、加入包被液、加入反应板、4'C湿盒 放置过夜、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒前Ｓ１与前Ｓ２联合检测试剂盒，其特征在于它包括抗体包被反应条、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色Ａ液、底物显色Ｂ液和终止液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龙琼英，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]