一种从人血浆中提取高密度脂蛋白及分离纯化载脂蛋白apoA-I的方法技术

本发明专利技术提供一种从正常人血浆中提取高密度脂蛋白（HDL）及分离纯化高纯度载脂蛋白apoA-I的方法。它包括以下步骤：1）用中性盐调节血浆到不同密度，采用序列梯度密度超速离心法，排除杂蛋白，获取高纯度HDL组分；2）获得的高纯HDL组分在低温冷冻状态下用一定比例醇醚溶剂进行流加法脱脂获取脱脂后apoHDL沉淀；3）用含1-8M尿素的TBS缓冲液体系复溶apoHDL沉淀并过滤，滤液先后经过分子筛层析和阴离子交换层析，分离纯化获得高纯度的apoA-I溶液。本发明专利技术的方法能够将很难除掉的白蛋白组分与HDL分离，本方法制备的apoA-I具有非常高的纯度和活性，纯度可达98%以上，被倍比稀释64倍后仍能与抗血清发生清晰沉淀反应，且操作安全方便，提取周期短，适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种从正常人血浆中提取高密度脂蛋白（HDL）及分离纯化高纯度载脂蛋白apoA-I的方法。它包括以下步骤：1）用中性盐调节血浆到不同密度，采用序列梯度密度超速离心法，排除杂蛋白，获取高纯度HDL组分；2）获得的高纯HDL组分在低温冷冻状态下用一定比例醇醚溶剂进行流加法脱脂获取脱脂后apoHDL沉淀；3）用含1-8M尿素的TBS缓冲液体系复溶apoHDL沉淀并过滤，滤液先后经过分子筛层析和阴离子交换层析，分离纯化获得高纯度的apoA-I溶液。本专利技术的方法能够将很难除掉的白蛋白组分与HDL分离，本方法制备的apoA-I具有非常高的纯度和活性，纯度可达98%以上，被倍比稀释64倍后仍能与抗血清发生清晰沉淀反应，且操作安全方便，提取周期短，适于工业化生产。【专利说明】一种从人血浆中提取高密度脂蛋白及分离纯化载脂蛋白apoA-1的方法
本专利技术生物
，具体涉及一种从正常人血浆中提取高密度脂蛋白(HDL)及分离纯化高纯度载脂蛋白apoA-1的方法。
技术介绍
流行病学调查表明，血浆高密度脂蛋白(HDL)水平与动脉粥样硬化(AS)发病率呈负相关，并具有对抗AS的作用。HDL主要由载脂蛋白和脂质组成，是血浆中密度最高但组成极不均一的一类脂蛋白。HDL中的蛋白质主要由apoA-1和apoA-1I构成，另还含有少量的apoA-1V、C1、CI1、CIII及E，其中apoA-1的含量最多而且又是HDL的主要功能蛋白质，因此用apoA_I的含量就可以反映HDL的含量，间接诊断AS的发病与否。apoA-1还具有抗炎抗内毒素的功能，因此是脂类代谢研究的重点之一。由于apoA-1具有肝脏靶向作用的特点，在靶向药物研究中也有良好的应用前景。目前，获得HDL的常用方法为超速离心法、聚合物及盐离子序列沉淀法等，但这些方法具有一些不可避免的缺点:1)处理方法繁琐，因HDL是血浆中密度最高但组成极不均一的一类脂蛋白，成分和条件复杂，无法仅靠沉淀法就能将HDL与其他成分完全分开，尤其是在血浆中含量最为丰富的白蛋白，而一旦在提取HDL阶段引入白蛋白，很难在后续色谱纯化中将其剔除；2)沉淀法整个处理过程需要将HDL组分经历多次液相/固相转换过程，处理期间温度变化频繁易导致HDL中所含蛋白氧化、变性，进而导致蛋白活性损失，无法后续利用。虽然超速离心法需要昂贵的仪器设备，但要获得高纯度、高活性的HDL及其蛋白组分，超速离心法仍然是目前提取的最佳`选择。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种超速离心法获取高纯度HDL的方法，尤其适用于对HDL及apoA-1的纯度要求非常高的原料的获取。本专利技术提供了一种从正常人血浆中提取高密度脂蛋白(HDL)及分离纯化高纯度载脂蛋白apoA-1的方法。该方法包括下列步骤:I)血浆组分用中性盐调节密度至L05-L 15g/ml，30000-80000rpm超速离心10-30h,收集下层深黄色组分I ;2)组分I用中性盐调节密度至1.15-1.35g/ml, 30000-80000rpm超速离心10_30h，收集上层浅黄色组分II ；3)配置密度为1.15-1.35g/ml中性盐水溶液，组分II和中性盐水溶液按体积比1:3-5 (V/V)混合，并调节混合溶液密度至1.15-1.35g/ml，30000-80000rpm超速离心5_30h，收集上层浅黄色组分III ;4)重复步骤3) 1-3次，收集获取上层浅黄色组分，即为除去杂蛋白的高纯度HDL ；5)采用改进Scanu (1971)法对HDL进行低温醇醚脱脂，得apoHDL沉淀；6)复溶apoHDL沉淀并过滤；7)步骤6)的滤液利用GE AKTA?快速蛋白层析仪purifierlOO系统，先后经分子筛层析及阴离子交换层析，纯化获得高纯度的apoA-1溶液。所述步骤I)中血浆为健康人群捐献的正常人血浆；所述步骤1)、2)、3)中调节密度所使用的中性盐优选而不局限于KBr、NaBr、NaCl、KCl，最优选NaBr。所述步骤1)、2)、3)中超速离心的转速为30000-80000rpm，优选而不局限于50000rpmo所述步骤1)、2)、3)中超速离心的离心时间为5_30h，优选而不局限于24h。所述步骤4)中使用生理盐水配置的密度为1.15-1.35g/ml，优选1.21g/mlNaBr密度液稀释HDL粗提组分，30000-80000rpm,优选而不局限于50000rpm，离心10-24小时，优选而不局限于24h，收集上层浅黄色组分；重复次数为1-3次，优选而不局限于2次。所述步骤5)中脱脂方法为改进Scanu (1971)法，使用的无水乙醇/无水乙醚的体积比为1-5:1，优 选而不局限于3:2。所述步骤6)中复溶apoHDL的复溶液为25mM Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐)缓冲液，内含尿素浓度为3-8M，优选而不局限于6M，复溶液的pH为7.0-9.0，优选而不局限于8.0。 所述步骤6)复溶后溶液采用0.2-0.5 μ m滤膜过滤，优选而不局限于0.22 μ m。所述步骤7)中使用的分子筛层析柱为Superdex G75分子筛层析柱，使用的离子交换柱为DEAE阴离子交换层析柱。所述步骤7)中分子筛层析的步骤为:用如上所述的步骤6)的蛋白复溶液为分子筛层析液，层析液中添加离子强度为50-350mM的NaCl，优选而不局限于150mM的NaCl，以降低凝胶的非特异性吸附；洗脱流速为0.5-2ml/min，优选而不局限于lml/min ;上样体积为层析柱柱床体积的1-5%,优选而不局限于3% ；所述步骤7中DEAE阴离子交换层析的步骤为:已经分子筛层析初步纯化的apoA-1层析液调整为ρΗ7.0-9.0，优选而不局限于8.0, Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐)缓冲液浓度为10-30mM,优选而不局限于25mM (内含尿素浓度为3-8M,优选而不局限于6M)后上DEAE阴离子交换柱，然后采用0-1M的NaCl线性洗脱，获得高纯度的apoA_I溶液。本专利技术方法通过调节不同的浮选密度搭配，利用序列超速离心法，很好的将血浆中丰度非常高并与HDL物理性质相近的白蛋白杂质与HDL分开，解决了以往传统HDL提取方法中仍含有少量白蛋白的难点，尤其适用于对HDL及apoA-1的纯度要求非常高的原料的获取。本方法制备的apoA-1具有非常高的纯度和活性，纯度可达98%以上，被倍比稀释64倍后仍能与抗血清发生清晰沉淀反应，且操作安全方便，提取周期短，适于工业化生产。【专利附图】【附图说明】图1Superdex G75分子筛层析图谱；图2Superdex G75分子筛层析分组分收集后SDS-PAGE图谱:Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；条带1:HDL ;条带2:G75峰I ;条带3:G75峰1、峰2交叉组分；条带4:G75峰3 ；图3DEAE阴离子交换层析图谱；图4DEAE阴离子交换层析后SDS-PAGE图谱:Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；从左至右本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从正常人血浆中提取高密度脂蛋白及分离纯化高纯度载脂蛋白apoA‑I的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：1）血浆组分用中性盐调节密度至1.05‑1.15g/ml,30000‑80000rpm超速离心10‑30h,收集下层深黄色组分I；2）组分I用中性盐调节密度至1.15‑1.35g/ml,30000‑80000rpm超速离心10‑30h,收集上层浅黄色组分II；3）配置密度为1.15‑1.35g/ml中性盐水溶液，组分II和中性盐水溶液按体积比1:3‑5混合，并调节混合溶液密度至1.15‑1.35g/ml，30000‑80000rpm超速离心5‑30h，收集上层浅黄色组分III；4）重复步骤3）1‑3次，收集获取上层浅黄色组分，即为除去杂蛋白的高纯度HDL；5）采用改进Scanu1971法对HDL进行低温醇醚脱脂，得apoHDL沉淀；6）复溶apoHDL沉淀并过滤；7）步骤6）的滤液利用GE AKTATM快速蛋白层析仪purifier100系统，先后经分子筛层析及阴离子交换层析，纯化获得高纯度的apoA‑I溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，张跃建，孙卫兵，
申请(专利权)人：上海复星医药集团股份有限公司，上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31