环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用。该发明专利技术通过对感染HCMV的细胞进行小RNA测序，发现HCMV感染后，会产生siRNA，激发RNAi抗病毒通路，而环丙沙星能够增强RNAi通路，从而在细胞内有效抑制HCMV的病毒水平，并能抑制HCMV病毒复制水平，达到预防和/或治疗HCMV感染引起的疾病。

【技术实现步骤摘要】
环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是一种DNA病毒，疱疹病毒家族中基因组最大的成员，属于β-疱疹病毒，可导致人类终生感染。HCMV在人群中感染非常普遍，在发达国家成年人HCMV抗体阳性率约为50％，我国则高达60％～80％。10％～15％儿童在5岁之前初次感染HCMV。原发性HCMV感染在健康宿主中一般无症状，但在免疫功能低下的个体和新生儿中可引起严重的、有时甚至致命的疾病。HCMV是世界上导致先天性畸形的主要传染源，宫内感染HCMV可引起明显的异常症状，包括出生时体重偏低、听力下降、视力损害、小头畸形、肝脾肿大或不同程度的智力低下。此外，HCMV在器官移植受者和艾滋病患者中也会引起严重的疾病。近年来，抗HCMV药物的研究取得了一定的进展，主要以如更昔洛韦等广谱抗病毒药物治疗以及干扰素治疗、对症治疗为主；虽然抗HCMV药物的临床应用经验日趋丰富，多种新型HCMV抑制剂也已经在体内体外试验中显示了良好的抗病毒活性，但是临床耐药病毒株亦呈增长趋势，目前仍然急需研发抗HCMV的特效治疗药物。天然免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防线。在哺乳动物中，宿主细胞可以通过自身编码的模式识别受体模式识别受体侦别病原相关分子模式，从而激活抗病毒天然免疫，诱导干扰素、促炎症因子等一系列抗病毒因子表达，抵御病毒感染。在真核生物中，存在一种由小分子干扰RNA(SmallinterferingRNA，siRNA，大小为21-24nt)介导的基因表达调控模式，被称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，在胚胎发育早期，主要是RNAi免疫通路起主要的抗病毒作用，大量研究表明，RNAi介导的抗病毒免疫在植物、昆虫和哺乳动物中均起到重要作用。对于包括疱疹病毒在内的动植物病毒，其在被感染的宿主细胞内复制增殖过程中，由于病毒基因组自身结构或者复制中间体的原因，会产生病毒来源的长双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，这些dsRNA被宿主Dicer蛋白识别并被切割成病毒衍生的小分子干扰RNA(viralsmallinterferingRNA，vsiRNA)，随后vsiRNA与Argonaute(AGO)蛋白结合并装配形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，最终介导病毒靶基因RNA的降解，从而抑制病毒的复制达到清除病毒的目的。因此，可开发一种新型的抗HCMV的治疗药物，来激活抗病毒天然免疫，从而抑制病毒的复制达到清除病毒的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发一种人巨细胞病毒抑制剂，来激活抗病毒天然免疫，从而抑制病毒的复制达到清除病毒的目的。为此，本专利技术提供了一种环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用。进一步的，所述环丙沙星通过增强人巨细胞病毒激发的RNAi通路抑制人巨细胞病毒的表达和复制。进一步的，所述环丙沙星抑制人巨细胞病毒的活性浓度为12.5～200μM。进一步的，所述人巨细胞病毒抑制剂包括活性成分以及药学上可接受的辅料，其中活性成分包括环丙沙星。本专利技术的有益效果：本专利技术中通过对感染HCMV的细胞进行小RNA测序，发现HCMV感染后，会产生siRNA，激发RNAi抗病毒通路，而环丙沙星能够增强RNAi通路，从而可在细胞内有效抑制HCMV的病毒水平，并能抑制HCMV病毒复制水平，达到预防和/或治疗HCMV感染引起的疾病。以下将结合附图对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1是HCMV感染滋养层细胞后的总RNA进行小RNA测序分析结果图；图2是带绿色荧光蛋白标记的HCMV感染HFF细胞模型的荧光显微镜图；图3是未经环丙沙星处理和经环丙沙星处理的GFP-HCMV感染细胞的荧光显微镜图；图4是环丙沙星对GFP-HCMV感染细胞的基因组水平抑制效果图；图5是环丙沙星对敲降细胞内Dicer，RNAi通路被抑制后HCMV基因组水平抑制效果图；图6是不同浓度环丙沙星抑制HCMV复制水平的IC50测定结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中提供的人巨细胞病毒抑制剂中所述原料及试剂均可由市场购得。实施例1：本实施例对HCMV感染滋养层细胞后，会激发RNAi通道，产生siRNA这一作用进行研究，具体过程如下：1.实验材料人滋养层细胞(trophoblasticcell)、野生型HCMV、含10％Gibco血清和2％双抗的滋养层细胞培养基、含2％血清的滋养层培养基、总RNA提取试剂盒(Gibco)。2.实验过程(1)用滋养层细胞铺24孔板；(2)待其长到70％-80％融合度时，将含10％Gibco血清和2％双抗的滋养层细胞培养基换成含2％血清的滋养层培养基(每孔培养基的加入量是0.5ml)，每孔加入5μl107PFU/ml野生型HCMV；(3)病毒感染48h后收样用总RNA提取试剂盒提取RNA；(4)弃去上清，向孔中加入350μlTRK裂解液，放到摇床上5min；(5)再向孔中加入350μl75％乙醇(DEPC)，放到摇床上5min；(6)取出孔中溶液转移至RNA提取柱子中，12000g离心1min；(7)将回收管中的溶液重新上一次柱子，12000g离心1min；(8)加入RNAwashingbuffer1，12000g离心30s；(9)加入RNAwashingbuffer2，12000g离心1min；(10)重复步骤(9)；(11)空离柱子12000g，2min，以完全去除残余RNAwasingbuffer；(12)加50μlDEPC水，12000g离心2min；(13)将得到的总RNA进行小RNA测序分析，结果如图1所示。由图1可知，通过对测序结果的分析比对，HCMV感染后，滋养层细胞内明显产生了来源于病毒的22ntsiRNA，此外在-2处也出现明显的峰，这一结果说明HCMV能激发RNAi通道，产生siRNA。实施例2：本实施例建立了带绿色荧光蛋白标记的HCMV感染HFF细胞模型，用于后续研究环丙沙星对HCMV的抑制作用，具体过程如下：1.实验材料人包皮成纤维细胞(HFF)、带绿色荧光蛋白标记的GFP-HCMV、含10％Gibco血清和2％双抗的DMEM培养基、含2％血清的DMEM培养基、荧光显微镜。...

【技术保护点】
1.环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.环丙沙星在制备人巨细胞病毒抑制剂中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述环丙沙星通过增强人巨细胞病毒激发的RNAi通路抑制人巨细胞病毒的表达和复制。


3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘愈杰，徐国东，幸晓莹，郑从义，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42